对GB_T 8313—2018标准中茶多酚重复性规定的探讨.pdf

中国茶叶 2023年10月 第45卷第10期China Tea,October 2023,Vol.45,No.10作者简介：王小乐，女，工程师，主要从事食品及茶叶检验、仪器检定与测试，E-mail：摘要：化学定量分析方法中重复性是对单次试验结果有效性的评定。通过重复性测量条件、评估数学模型、不确定度来源、合成标准不确定度以及茶叶中茶多酚含量范围的不同，对茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法（GB/T 83132018）中茶多酚含量重复性规定进行探讨。结果表明，测定茶多酚含量时，在考虑测量系统与操作条件不确定度的同时，应结合不同茶叶中茶多酚含量检测的差异大的特点，综合考量、合理制定重复性相对误差。关键词：茶多酚；重复性条件；不确定度；相对误差；GB/T 83132018中图分类号：TS272.7文献标识码：A文章编号：10003150（2023）10-25-6对GB/T 83132018标准中茶多酚重复性规定的探讨王小乐汉中市质量技术监督检验检测中心，陕西 汉中 723000Discussion on the Repeatability Regulation of TeaDiscussion on the Repeatability Regulation of TeaPolyphenols in GB/TPolyphenols in GB/T 8313831320182018WANG XiaoleHanzhong Quality and Technology Supervision Inspection and Testing Center,Hanzhong 723000,ChinaAbstract:Abstract:Repeatability in chemical quantitative analyses is an evaluation of the effectiveness of a single test result.Thearticle discussed the repeatability regulation of tea polyphenols in GB/T 83132018,by analyzing repeatabilitymeasurement condition,evaluating mathematical model,sources of uncertainty,combined standard uncertainty and arange of tea polyphenols content in teas.It was concluded that the relative error of repeatability should be reasonablydetermined,considering the uncertainty of measurement system and operation condition and widely varied tea poly-phenols contents in different teas.Keywords:Keywords:tea polyphenols,repeatability conditions,uncertainty,relative error,GB/T 83132018茶多酚是茶叶在生长过程中自然形成的天然物质，是决定茶叶滋味品质的关键成分。同时茶多酚具有抗氧化、抗辐射等保健功效，近年来倍受商家及消费者关注。我国颁布实施的茶叶及茶制品国家标准均对产品中茶多酚含量及检测方法有明确规定。我国推荐的现行有效测定茶多酚含量的方法是茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测 方 法（GB/T 83132018，以 下 简 称“方法”）中的第二法。该方法为茶叶及其制品在产品开发、生产加工及市场销售阶段提供茶多酚含量测定的技术支持。该方法中检测茶多酚含量的重复性规定为“同一样品茶多酚含量的两次测定值（化学分析中称作“平行样”）相对误差应5%”1。截至目前，未有相关文献对检测茶多酚含25中国茶叶 2023年10月 第45卷第10期China Tea,October 2023,Vol.45,No.10量的重复性规定值进行分析研究。本文从重复性定义和数学模型入手，找出影响茶多酚测定结果的因素来源，并通过不确定度量化评定，对其重复性规定的合理性进行验证。1 重复性的测量条件在化学分析试验中，重复性体现测试结果的一致程度。测量重复性，指在一组相同测量程序、相同操作者、相同测量系统、相同操作条件和相同地点，并在短时间内对同一或相类似被测对象重复测量的测量精密度2。如果重复性不能满足要求，说明测得结果不满足一致程度。1.1 相同测量程序方法中对原理、仪器、试剂、操作方法、测定及结果计算作出明确规定。平行样操作的所有程序应是不变的，可视为相同。1.2 相同操作者平行样由一人独立操作完成，整个测试及结果计算过程，可视为相同。1.3 相同测量系统检测中所用仪器包括天平、水浴锅、离心机、分光光度计，在试验过程中均由同一设备完成。但由于平行样称量、提取、稀释、测定等操作是独立进行的，仪器的示值误差和重复性误差会带来测定结果的不一致。过程中还需要使用玻璃量器，如：移液管、容量瓶。这些器具引入的体积、温度和读数误差也应一并考虑，所以测量系统不能视为完全相同。1.4 相同操作条件方法中规定了水浴温度和时间、离心机转数和时间、加入福林酚试剂的反应时间以及测定前静置时间。从理论上讲，整个试验过程是在相同操作条件下进行的，但实际操作过程中由于该试验操作步骤繁琐，人工操作很难保证每个步骤所用时间完全相同，平行样在操作过程中或多或少会引入时间和温度上的波动，所以操作条件不能视为完全相同。1.5 相同地点在相同的实验室内进行测试，可视为相同。1.6 在短时间内重复测量方法中多处对时间有严格要求，整个过程满足在短时间内重复测试，可视为相同。通过对重复性测量条件的分析，可以看出测量系统和操作条件是引入误差的主要来源。2 评估模型及建模分析2.1 评估数学模型（1）（2）式中：x1、x2为单次测定茶多酚含量（%）；x为茶多酚含量的平均值；c1为测试液中茶多酚的质量浓度（g/mL）；v为提取液定容体积（mL）；m1为茶样质量（g）；m0为茶样干物质百分含量（%）；d为稀释因子。2.2 数学模型分析从式（1）中可知，有x1、x2、x这3个变量，x1和x2为平行测定的两份样品，分别由试验测定并通过式（2）计算得出，x由（x1+x2）/2 计算得出。理想情况下x1=x2=x，但试验中不可避免随机误差和系统误差的存在。假设对同一茶样同时测定n份，（x1，xn）为茶多酚含量测定结果区间，x为中位值，这样就形成了一个正态分布，（x1，xn）为x的分散程度。要满足相对误差5%，（x1，xn）的分散程度越小越好。x由（x1xn）/n计算得到，其值大小主要由茶叶特质决定。因原料鲜叶和生产工艺的不同，茶叶中茶多酚含量差异从3%到34%不等3。从式（2）中可以看出，茶多酚的含量与c1、m1、m0、v、d这5个参数相关，v和d是固定值，平行相相对误差茶多酚含量26中国茶叶 2023年10月 第45卷第10期China Tea,October 2023,Vol.45,No.10天平允差移液管体积温度定容体积提取液体积温度温度定容体积移液管体积标液配制移液管读数温度仪器允差吸光度测定定容体积天平允差标品纯度标准储备液茶多酚含量天平允差天平允差天平允差dm0m1vc1m皿m干样m皿m皿m样图1 测定过程中各参数对测定结果影响的鱼骨图分别代表提取定容体积、稀释倍数，但在实际操作中体积和温度会引入随机误差，所以式（2）中5个参数都会对测试结果茶多酚含量产生影响，这也是造成x1x2、x1xn的原因所在。通过图1清晰地反映出各参数中影响茶多酚测定结果的来源，通常量化采用不确定度进行评定4-7。3 试验方法3.1 原理以甲醇水溶液作为提取液，对磨碎茶叶样品进行浸提，待测液在碱性条件下，茶多酚中OH基团被福林酚氧化显蓝色，在765 nm波长下，以没食子酸作标准曲线，测定茶多酚含量。3.2 操作方法3.2.1 样品母液制备精确称取0.2 g茶样于离心管中，加入70%甲醇水溶液5 mL后，水浴加热（70）10 min，边加热边搅拌。待冷却后以3 500 r/min离心10 min，移出上清液。残渣按上述操作再重复提取1次，合并上清液定容至10 mL。3.2.2 标准储备液配制精确称取0.110 g没食子酸标准品，加70%甲醇水溶液溶解，定容于100 mL容量瓶。3.2.3 没食子酸工作液配制分别移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL没食子酸标准储备液，加水定容于100 mL容量瓶。3.2.4 样品测试液配制移取1.0 mL母液加水定容于100 mL容量瓶。3.2.5 测定移取没食子酸工作液、水及样品测试液各1.0 mL，分别加入5.0 mL福林酚试剂，摇匀放置5 min，加入 4.0 mL7.5%碳酸钠溶液摇匀，放置1 h，用1 cm比色皿测定吸光度。4 不确定度来源及评定4.1 不确定度来源通过对数学模型的分析，梳理出测定茶多酚含量的不确定度分量、不确定度具体来源及影响因素（表1）。4.2 不确定度分量评定4.2.1 样品称量引入的不确定度ur（m样）称取0.2 g茶样，应选I级天平称量，050 g称量范围允许误差为0.000 5 g8，按照均匀分布（k=），样品称量的相对标准不确定度为0.000 5/0.2=1.4410-3。4.2.2 样品干物质引入的不确定度ur（m干）干物质含量测定采用恒重法，采用天平称重9。称取5.0 g茶样，参照4.2.1中天平允差数据及分布，样品干物质的相对不确定度为0.000 5/5.0=5.810-5。定容体积27中国茶叶 2023年10月 第45卷第10期China Tea,October 2023,Vol.45,No.104.2.3 标品纯度引入的不确定度ur（p）没食子酸标品的纯度为99.47%，扩展不确定度为0.30%，按照均匀分布，没食子酸纯度的相对不确定度为0.003/0.994 7=1.7410-34.2.4 标品称量引入的不确定度ur（m标）称取0.110 g没食子酸标品，参照4.2.1中天平允差数据及分布，标品称量的相对标准不确定度为0.000 5/0.110=2.6210-3。4.2.5 标品定容引入的不确定度ur（v标定）（1）本试验全部选用A级玻璃量器，标品定容于100 mL容量瓶，体积允差为0.10 mL10，按照三角分布（k=），体积校准的相对标准不确定度为0.10/100=4.0810-4。（2）方法中未对标品定容试剂做具体规定，考虑标品制备和样品制备保持一致原则，选择用70%的甲醇水溶液定容。玻璃量器在20 校准，而实验室温度在（204）范围波动。水的膨胀系数为2.0810-4/，甲醇的膨胀系数为1.1810-3/，70%甲醇水溶液的膨胀系数为0.71.1810-30.32.0810-4=8.8810-4/。依据膨胀效应体积变化为（10048.8810-4）mL=0.355 2 mL，按照均匀分布，溶液温度引入的体积变化相对标准不确定度为0.355 2/100=2.0510-3。标品定容的合成相对标准不确定度见式（3）。4.2.6 标液配制引入的不确定度ur（v标配）（1）标液配制使用5 mL刻度移液管和100 mL容量瓶，体积允差分别为0.025 mL、0.10 mL，参照4.2.5（1）中方法计算，移液管体积校准的相对标准不确定度为2.0410-3，容量瓶体积校准的相对标准不确定度为4.0810-4。（2）移取液体会因温度变化带来溶剂体积变化，参照4.2.5（2）中70%甲醇水溶液的膨胀系数8.8810-4/，移液管体积产生的变化为（548.8810-4）mL=1.7810-2mL，按照均匀分布，移取溶液时温度引入的体积变化相对标准不确定度为2.0610-3。定容所用试剂为纯水，水的膨胀系数为2.0810-4/，体积产生的变化为（10042.0810-4）mL=8.3210-2mL，定容时溶液温度引入的体积变化相对标准不确定度为4.810-4。（3）配制标准系列时，移液管移取没食子酸标准储 备 液 会 引 入 读 数 误 差，一 般 估 计为 0.01 mL，按照三角分布，读数的相对不确定度为0.01/5=8.1610-4。标液配制的合成相对标准不确定度见式（4）。表1 不确定度来源分析不确定度分量样品称量样品干物质称量标准储备液标液配制母液提取母液定容稀释倍数吸光度测定不确定度来源天平天平标品天平体积（100 mL）体积（移液管5 mL）体积（容量瓶100 mL）体积（5 mL）体积（10 mL）体积（移液管1 mL）体积（容量瓶100 mL）紫外分光光度计不确定度因素称量误差称量误差纯度误差称量误差体积允差、温度体积允差、读数、温度体积允差、温度体积误差体积允差、温度体积允差、温度体积允差、温度示值误差（3）ur（v标定）=（4）ur（v标配）=4.2.7 母液提取引入的不确定度ur（v提）母液提取离心后，由人工手动转移上清液，该步骤不能保证每次移取体积相同，根据经验引入的不确定度估计为 0.05 mL，故 a=0.025 mL，按照三角分布（k=），提取液移取的相对标准不确定度为0.025/5=2.0410-3。4.2.8 母液定容引入的不确定度ur（v提定）（1）提取液定容于10 mL容量瓶，体积允差为0.020 mL，按照三角分布，体积校准的相对标准不确定度为8.1610-4。（2）母液用70%甲醇水溶液定容，体积产生的变化为0.035 5 mL，按照均匀分布，溶液温度引28中国茶叶 2023年10月 第45卷第10期China Tea,October 2023,Vol.45,No.104.2.10 紫外分光光度计引入的不确定度ur（A）该试验采用岛津UV-2600紫外分光光度计，等级为级，波长765 nm属于B段，该段的透射比最大允许误差0.00511，按照均匀分布，紫外分光光度计的标准不确定度为0.005/=2.8910-3。4.3 合成不确定度及扩展不确定度将4.2所有不确定度分量按质量、体积、吸光度、标品纯度分别拟合，最终计算合成标准不确定度：5.8510-3。按95%置信概率，取包含因子k=2，扩展不确定度U=kuc=0.015。各项不确定度的贡献率见表2。5 分析讨论从表2不确定度的贡献率可以看出，体积引入的不确定度最大。这与试验过程复杂，使用大量玻璃量器有直接关系。该试验选用I级电子天平和级紫外分光光度计，仪器精度等级较高，但质量和吸光度的不确定度贡献率依然高达 22.20%、21.45%。标品纯度引入的不确定度最小，按照小于最大分量三分之一可以不予考虑12。uc值为测量茶多酚含量引入的合成标准不确定度，具有分散性和非负数特征。假设被测量茶多酚含量的可能值在yuc，yuc区间内，为使uc与y量纲相同，uc值乘以 100%为 0.74%。分别以y=20%，y=30%代入式（1）计算。当茶叶中茶多酚含量y=20%，平行样相对误差（%）=当茶叶中茶多酚含量y=30%，平行样相对误差（%）=通过代入不同的茶多酚含量值计算平行样相对误差。茶多酚含量为 20%的茶样，相对误差5%，不满足重复性结果一致程度；茶多酚含量为30%的茶样，相对误差5%，满足重复性结果一致程度。试验证明，在平行样分散度相同的情况下，茶多酚含量值越大，相对误差越小。6 结论本文通过对茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法（GB/T 83132018）中茶多酚含量测定的全面分析得出，测试结果的重复性与平行样分散度、茶叶自身的茶多酚含量相关。要得到入的体积变化相对标准不确定度为2.0510-3。母液定容的合成相对标准不确定度见式（5）。4.2.9 稀释倍数引入的不确定度ur（v稀）（1）配制样品测试液使用1 mL移液管和100 mL容量瓶，体积允差分别为0.008 mL、0.10 mL，按照三角分布，移液管体积校准的相对标准不确定度为3.2710-3，容量瓶体积校准的相对标准不确定度为4.0810-4。（2）移液管因温度变化产生的体积变化为（142.0810-4）mL=8.3210-4mL，按照均匀分布，移液管温度变化的相对标准不确定度为 4.810-4，参照4.2.6（2）中容量瓶温度引入的体积变化相对标准不确定度为4.810-4。稀释倍数的合成相对标准不确定度见式（6）。表2 茶多酚测定的相对不确定度分量不确定度分量质量引入的不确定度体积引入的不确定度吸光度引入的不确定度标品纯度引入的不确定度相对标准不确定度0.002 990.005 850.002 890.001 74不确定度的贡献率/%22.2043.4321.4512.92（5）ur（v提定）=（6）ur（v稀）=其中2.9910-3、7.410-3。29中国茶叶 2023年10月 第45卷第10期China Tea,October 2023,Vol.45,No.10较小的分散度，尽可能选用玻璃量器A级中检定或校准容量偏差较小的产品。选用灵敏度较高的仪器，并定期做好电子天平和紫外分光光度计的检定校准及日常维护。操作人员应熟悉操作方法，在试验过程中保持操作顺畅，同一过程尽可能所用时间相同。同时，能否获得满意的重复性结果与茶叶中茶多酚含量关系密切。由于茶树品种和生长环境的不同，以及六大茶类不同的生产工艺，使得茶叶中茶多酚含量差异较大，必须综合考虑茶叶自身的特点，针对不同茶多酚含量科学制定相对误差值，才能对其测试结果一致性进行有效判定。参考文献1 国家市场监督管理总局,国家标准化管理委员会.茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法:GB/T 83132018S.北京:中国标准出版社,2018.2 国家质量监督检验检疫总局.通用计量术语及定义:JJF 10012011S.北京:中国质检出版社,2012.3 肖涵,杨婉秋,缪德仁.云南省不同制茶品种不同产区茶多酚含量分析J.昆明学院学报,2016,38(6):43-46.4 国家质量监督检验检疫总局.化学分析测量不确定度评定:JJF11352005S.北京:中国计量出版社,2005.5 国家质量监督检验检疫总局.测量不确定度评定与表示:JJF1059.12012S.北京:中国标准出版社,2013.6 程家丽,刘婷婷,马彦宁,等.保健食品茶多酚测定的不确定度评定J.职业与健康,2017,33(10):1327-1331.7 陈孝权,肖海军.分光光度法测定茶叶中茶多酚含量的不确定度评估J.化学通报,2013,76(10):945-949.8 国家市场监督管理总局.电子天平检定规程:JJG 10362022S.北京:中国标准出版社,2023.9 国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会.茶 磨碎试样的制备及其干物质含量测定:GB/T 83032013S.北京:中国标准出版社,2014.10 国家质量监督检验检疫总局.常用玻璃量器:JJG 1962006S.北京:中国计量出版社,2007.11 国家质量监督检验检疫总局.紫外、可见、近红外分光光度计:JJG 1782007S.北京:中国质检出版社,2008.12 中国合格评定国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南:CNAS-GL0062019S.北京:中国质检出版社,2019.注：资料来源于国际茶叶委员会。t2023年6月中国茶叶出口各国和地区销量统计出口国家和地区英国法国德国荷兰波兰俄罗斯联邦乌兹别克斯坦其他独联体其他欧洲国家加拿大美国阿富汗中国香港伊朗日本马来西亚缅甸巴基斯坦新加坡泰国越南其他亚洲国家阿尔及利亚贝宁2022年6月1744757311822859551 1967701961261 211378916611 084876119182647252677277864492023年6月1111307311822859153 0446174571054739276632919759175446384694007001 5631 2242022年前6个月出口总量1 0302 8874 7059572 4887 07611 9354 6172 7774407 1321 7045 4132584 7733 6572932 0672944 4281 8954 7767 1113 0422023年前6个月出口总量6591 4174 1048562 8856 98914 1153 3683 2024083 6219884 0231535 2804 4393931 9772202 9492 1776 37410 2047 680出口国家和地区喀麦隆冈比亚加纳利比亚马里毛里塔尼亚摩洛哥尼日尔塞内加尔多哥突尼斯其他非洲国家澳大利亚其他国家总计按茶类分红茶绿茶乌龙茶茉莉花茶普洱茶黑茶白茶2022年6月2 1503762 0578103813535 0865341 1961 136493649297628 2612 24023 3201 979494166622023年6月3834382 9516831 2781 0353 5876631 468583891275328 6732 45923 6311 59445710024212022年前6个月出口总量7 2962 54511 1213 0823 9036 67038 4062 9738 4933 7641 2554 331127679180 40014 042152 5659 6872 8831 0511732023年前6个月出口总量4 7033 72515 7263 6645 6078 09122 6323 9668 1863 4499025 228128449174 93713 401146 31211 0222 74587213828030