GBT19180-2020牛海绵状脑病诊断技术国家标准规范.pdf

书 书 书犐 犆犛 犅?犌犅犜?犇 犻 犪 犵 狀 狅 狊 狋 犻 犮狋 犲 犮 犺 狀 犻 狇 狌 犲 狊犳 狅 狉犫 狅 狏 犻 狀 犲狊 狆 狅 狀 犵 犻 犳 狅 狉犿犲 狀 犮 犲 狆 犺 犪 犾 狅 狆 犪 狋 犺 狔?书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准代替 牛海绵状脑病诊断技术。本标准与 相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：增补了组织病理染色法、免疫组织化学方法和免疫印迹方法的适用范围，删除了“也可用于其他动物的传染性海绵状脑病的诊断”（见第章）；优化了临床症状的描述（见）；优化了组织病理染色法操作步骤（见）和免疫组织化学方法操作步骤（见）；增补了免疫印迹方法（见）。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（）归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人：王志亮、刘雨田、孙成友、迟田英、宋芳芳、邹艳丽、于小静、吴晓东、王树双。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：。犌犅犜 引言牛海绵状脑病（，）是由朊病毒引起的牛的一种慢性致死性神经性疾病，对动物和人构成较大危害。世界动物卫生组织（）将其列为严重影响国际贸易的动物疫病之一，我国将其归为一类动物疫病。我国现行牛海绵状脑病诊断技术（）系 年月日由原国家质量监督检验检疫总局发布，年 月日起实施。该标准仅包括临床症状、组织病理学、免疫组织化学等三种诊断方法，未包括 陆生动物手册指定的另一种确诊方法即免疫印迹。免疫印迹方法比免疫组织化学方法更灵敏，特异性更好。因此，免疫印迹方法是牛海绵状脑病诊断技术中一种更好的确诊方法，它能更好地服务于我国疯牛病的监测工作。分为典型和非典型。典型是由于牛采食污染牛羊朊病毒的肉骨粉或者饲料而引起，非典型为自然发生的一种散发性。自然条件下，经由消化道传播，未发现水平和垂直传播的证据。典型的潜伏期一般为年年，平均为年年，多发于岁的牛，岁以下罕见，岁以上明显减少。根据病原的分子量大小，非典型又分为型和型。非典型的平均发病年龄为 岁。病程多为数月至一年，最终死亡。大多数病牛无典型临床症状，因此的诊断应通过实验室检测来实现。的病原是动物机体内朊蛋白的异构体，在病牛血清里检测不到朊病毒抗体，所以血清学检测方法对于来说是无意义的。目前，实验室诊断方法多以检测病原为目的，包括免疫组织化学方法、免疫印迹方法、方法等，其中免疫组织化学方法和免疫印迹方法是 手册规定的确诊方法。病牛的中枢神经被朊病毒侵害会出现海绵状空泡变性，在中枢神经保存良好且未发生自溶的情况下，应用组织病理染色法可以观察到这些病变情况。手册规定组织病理染色法是确诊的辅助方法，在使用免疫组织化学方法诊断时应同时使用组织病理染色法予以辅助确诊；在使用免疫印迹方法诊断时，如果样品适合进行组织病理染色，那么也应同时使用组织病理染色法予以辅助确诊。犌犅犜 牛海绵状脑病诊断技术范围本标准规定了诊断的临床诊断、实验室诊断及综合判定技术要求。本标准适用于的诊断，其中临床诊断适用于的监测和流行病学调查，组织病理染色法适用于中枢神经系统的病理诊断，免疫组织化学方法和免疫印迹方法适用于的病原学诊断。缩略语下列缩略语适用于本文件。：牛海绵状脑病（）：苏木精伊红（）：辣根过氧化物酶（）：磷酸盐缓冲溶液（）酶：蛋白酶（）：聚偏氟乙烯（）：十二烷基硫酸钠（）：等渗缓冲盐溶液（）临床诊断 易感动物牛科和猫科动物，包括各种牛、各种羊和各种猫科动物。临床症状 行为异常表现为不安、恐惧、异常震惊或沉郁；不自主运动，如磨牙、震颤；不愿经过有缝隙的地面或进入畜栏等。感觉或反应过敏表现为视、听、触三觉过于敏感。对光线的明暗变化、外部声响以及颈部触摸过度敏感，这是病牛的特征性临床表现。运动异常病牛步态呈“鹅步”状，共济失调，四肢伸展过度，有时倒地，难以站立。体重和体况下降病牛的体重和体况下降，表现出异常消瘦，体质虚弱。犌犅犜 病理变化剖检无明显病变。结果判定易感动物出现上述临床症状，又不能确定为其他疾病时，可判定为疑似。确诊应采集易感动物的脑组织进行实验室诊断。实验室诊断 犎犈组织病理染色法 实验室生物安全要求实验操作应在生物安全级以上的实验室进行。涉及有毒挥发性试剂的操作应在通风橱中进行，如甲醛、甲酸、二甲苯、氯仿等。仪器设备显微镜、切片机、电锯钢锯、骨钳、眼科剪、直形镊（长约）、手术刀、切片刀、烘烤箱、脱水筐、染色缸、包埋模具、载玻片、盖玻片、玻璃棒、染色架、量筒（量程分别为 、）、通风橱。试剂 蒸馏水。中性福尔马林固定液（见附录中）。无水乙醇。二甲苯。氯仿。软蜡（熔点）。硬蜡（熔点）。苏木素染液（染液，见）。盐酸酒精（见）。饱和碳酸锂水溶液（见）。酒精伊红溶液（见）。中性树胶。无机试剂原料均为分析纯。采样将牛头固定，用电锯从前额两牛角根部向枕骨大孔背侧缘方向锯开，使脑部暴露。剪开脑膜并切断所有与脑部相连的神经和血管，取出整脑，包括大脑、小脑和完整脑干。大规模监测采样时，可用专用采样勺（国家牛海绵状脑病参考实验室提供）从枕骨大孔处取出延脑部组织即可。采样勺取样时，先上下左右四个方向剪开脑硬膜，再用戴一次性乳胶手套的手指绕延脑转一转以切断脑神经和血管，然后紧贴颅腔壁插入采样勺，插入深度约。用力将采样勺的手柄往上翘，再往下切断脑组织，然后左右切断脑组织，最后将切下的脑组织往外抠出。犌犅犜 固定将所有组织直接放入 倍体积的 中性福尔马林固定液中渗透固定，换新配制的固定液再固定。组织切片制作 取材把大脑、小脑、脑干组织分离开，分别横切成厚的组织块，选取以下部位组织做进一步处理，包括大脑、小脑、脑桥、丘脑、四叠体、脑闩、延髓。适当修剪这七块用于检测的组织边角以适用脱水筐大小，剩余组织继续固定以备用。用脱水筐装好检测用的组织块，并用铅笔做好标记，盖好脱水筐盖。投入新配制的 倍体积的固定液再固定。甲酸处理将装有组织块的脱水筐移入 甲酸中作用，自来水冲洗 ，然后再移入新配制固定液中处理。脱甲醛将装有组织块的脱水筐放入染色缸中，用缓慢流动的自来水漂洗。脱水将装有组织块的脱水筐放入染色缸中，依次在以下梯度酒精中分别脱水：）酒精浸泡。）酒精浸泡。）酒精浸泡。）酒精浸泡。）酒精浸泡。）酒精浸泡。透明 氯仿浸泡 或者二甲苯浸泡 。氯仿浸泡或者二甲苯浸泡 。浸蜡依次在以下石蜡中浸蜡，温度为：）软蜡浸泡 。）软蜡浸泡。）硬蜡浸泡。包埋 若包埋模具为金属条结构的，则先组装好包埋模具，放置在光滑平整的金属台面上，再将熔化的新硬蜡倒入包埋模具里，直至倒满，然后将浸好蜡的组织块放入其中（待切片的一面朝下，并放平整）。如果一个模具里可以放置多个组织，则两个组织之间距离应大于。冷却过夜，用切片刀修犌犅犜 切成形，获得平整的石蜡组织块，然后给每个组织块贴上标签。如果包埋模具为凹型的用于单个组织包埋的模具（常见包埋机所用模具），则先将模具加热至，放置在同样温度的金属台面上，然后滴满熔化的新硬蜡，再将浸好蜡的组织块放入其中（待切片的一面朝下，并放平整），用去除盖子的脱水筐（尺寸与包埋模具匹配）放于其上，最后将整个包埋模具（包括组织等）平移至冷台上。待冷却好后，将脱水筐从包埋模具中取出，获得平整的石蜡组织块，然后给每个组织块贴上标签。切片将石蜡组织块切成厚的组织薄片。每块组织连续切片片 片，切片刀、碎屑和废弃组织应焚烧处理。组织薄片用干净的粘附剂预处理过的载玻片贴片（组织应贴在磨砂面标记面的同侧，以便给玻片做标记），然后用铅笔在载玻片上做好标记。烤片贴好组织薄片的载玻片先在自然条件下晾干，然后放入烘烤箱中 烘烤以上。组织染色 脱蜡和脱二甲苯取烘烤好的玻片整齐放入染色架上，依次在以下试剂中脱蜡和脱二甲苯：）二甲苯 。）二甲苯 。）酒精。）酒精。）酒精。）酒精。）酒精。）酒精。）自来水洗。犎犈染色 苏木素染液 。自来水漂洗。盐酸酒精。自来水漂洗。饱和碳酸锂水溶液。自来水漂洗 。酒精。酒精。酒精伊红液。脱水和透明 酒精。酒精。犌犅犜 酒精。二甲苯。二甲苯。封片用干净玻璃棒取一滴中性树胶，滴加在玻片的组织上，再用干净的盖玻片进行封片，放置在平整的台面上使其自然干燥。镜检及判定 分别在倍数为 、和 的光学显微镜下观察切片。阳性结果。灰质区出现空泡变性，特别是神经纤维网浆和神经细胞内有规则的圆形或卵圆形空泡，空泡内不着色或被伊红淡染，界限明显，胞核被挤压于一侧，甚至消失；有的神经细胞被单个或多个特异性空泡胀大，成为“气球样”空泡性神经细胞。容易出现空泡病变的部位是中脑和延髓的核群，且呈双侧对称性分布。阴性结果。灰质区无特征性空泡变性。在正常情况下，动眼神经核和红核处的核周质也可能有少量空泡出现，但不呈双侧对称，应注意区别。若在脑干灰质区未发现双侧对称性海绵状空泡病变，则用免疫组织化学方法做进一步诊断。组织病理学诊断只是疯牛病确诊的辅助方法，确诊时应结合免疫组织化学或免疫印迹诊断方法。免疫组织化学方法 实验室生物安全要求见 。仪器设备见 。另外，还需要高压锅（温度能达到 ）、水浴锅、恒温箱、冰箱（含冷冻和冷藏）、电磁炉、金属锅（烧水用）、陶瓷锅（直径不少于）、湿盒（在玻片盒的底部铺上湿的吸水纸便成了湿盒）、微量移液器（量程分别为 、）。试剂 蒸馏水。中性福尔马林固定液（见）。无水乙醇。二甲苯。氯仿。软蜡（熔点）。硬蜡（熔点）。蛋白酶缓冲液（见附录中）。蛋白酶工作液（见）。高压缓冲液（见）。双氧水甲醇（见，如果免疫组织化学显色试剂盒中带有类似的试剂，则使用试剂盒中的试剂）。（见）。犌犅犜 正常猪血清（见，如果免疫组织化学显色试剂盒中带有类似的试剂，则使用试剂盒中的试剂，但不得使用反刍动物源性血清）。氏苏木素液（商品化产品）。水溶性封片剂（商品化产品）。二步法免疫组织化学显色试剂盒（商品化产品，其中二抗应为抗鼠二抗）。一抗（商品化产品）工作液（见）。无机试剂原料均为分析纯。采样见 。固定见 。组织切片制作见 。免疫组织化学操作步骤 设置对照。免疫组织化学诊断应设置疯牛病阳性和阴性对照组织切片。脱蜡和脱二甲苯。取烘烤好的玻片和对照切片整齐放入染色架上，依次在以下试剂中脱蜡和脱二甲苯：）二甲苯 。）二甲苯 。）酒精。）酒精。）酒精。）酒精。）酒精。）酒精。）自来水洗。从自来水中取出装有玻片的染色架，在中洗 次。在洗第一次的同时，配制适量的蛋白酶缓冲液，并放入水浴锅中预热。另外，取出冷冻的蛋白酶母液使其化冻，以待用。在最后一次漂洗时，配制好蛋白酶工作液。洗完后，立即将玻片放入装有蛋白酶工作液的染色缸中，并确保玻片全部浸入液体，在 水浴中消化处理 。与此同时，准备好煮沸的蒸馏水，并配制好高压缓冲液。将高压缓冲液倒入陶瓷锅，并立即将玻片放入其中，确保玻片完全浸入水中，盖好盒盖，在 （约 ）高压处理 ，自然冷却至 以下取出。在中洗 次，洗最后一遍时配制好双氧水甲醇溶液。将玻片完全浸入双氧水甲醇溶液中室温处理。在中洗 次。如果正常猪血清是冷冻的，则需要提前取出化冻，用前 配制好。在玻片的组织上滴满正常猪血清，置湿盒中轻轻盖上盖子，室温作用 。同时，取出犌犅犜 冷冻的一抗进行化冻，并配制好工作液。弃去正常猪血清，用吸水纸吸干组织四周的液体。将一抗工作液滴加在组织上，确保组织完全覆盖，湿盒中 作用，或者在下作用过夜。在中洗 次，同时取出下保存的免疫组织化学显色试剂盒，使其回温至室温状态。洗完后用吸水纸吸干组织四周的液体，然后在组织上滴满显色试剂盒中的标记聚合物的抗鼠二抗，湿盒中室温作用 。在中洗 次。洗完后用吸水纸吸干组织四周的液体，然后在组织上滴满试剂盒中的底物显色液，确保组织完全覆盖，湿盒中室温作用 。在蒸馏水中漂洗 次。将玻片放入 氏苏木素液复染作用。在蒸馏水中漂洗。用水溶性封片剂封片。结果判定 在阳性和阴性对照片染色结果正确的情况下，分别在倍数为 、和 的光学显微镜下观察组织玻片，进行结果判定。阳性结果：脑组织灰质区特别是脑闩部的迷走神经背核、孤束核和三叉神经脊束核等处出现特异性颗粒状染色，则判定为疯牛病阳性。阴性结果：脑组织灰质区未见特异性颗粒状染色，则判定为疯牛病阴性。免疫印迹方法 实验室生物安全要求见 ，但组织匀浆、消化及变性时需在负压罩下操作。仪器设备电泳仪、半干转印仪、组织匀浆机、化学发光成像仪、冰箱（含冷冻和冷藏）、温箱（能恒定在）、金属浴、摇床、电子天平、平皿（直径为 ）、玻璃棒、眼科剪、眼科镊、保鲜膜、玻璃板（大小约 ）、专用铲刀（用于撬开预制胶）、塑料桶、微量移液器（量程分别为 、）。试剂 蒸馏水。道泳道的 胶（又称预制胶，商品化产品）。预染蛋白质 （商品化产品，应含有 之间的蛋白条带）。匀浆缓冲液（见附录中）。蛋白酶溶液（见）。消化阻止液（见）。上样缓冲液（见）。电泳缓冲液（商品化产品，与 匹配）。犌犅犜 甲醇。（见）。转印缓冲液（见）。封闭液（见）。膜。滤纸。一抗（商品化产品）工作液（见）。标记的兔抗鼠（商品化产品）工作液（见）。化学发光显色试剂盒（商品化产品）。阳性对照（见 ）。阴性对照（见 ）。无机试剂原料均为分析纯。采样通过枕骨大孔采集脑闩部组织，并于 冷冻保存待用。实验操作步骤 样品处理取 脑闩部组织放入 的专用匀浆管中，加入 匀浆缓冲液。用匀浆机以 的速度匀浆 。将匀浆好的样品吸取到 离心管中，以 犵离心，然后将上清移至另一离心管中。犘犓酶消化取 离心好的样品、阳性对照、阴性对照分别移至 离心管中，各加入蛋白酶溶液，使蛋白酶终浓度达到 以上，混匀后放在 金属浴中消化 。为防止消化过程中离心管盖被热气体撑开，可以加一重物如铁块压住盖子。消化完后各加入消化阻止液阻止蛋白水解反应。蛋白变性在消化完的样品、阳性对照、阴性对照中分别加入 上样缓冲液，混匀后置 金属浴中变性。电泳 将预制胶安放好，在电泳槽内槽加满电泳缓冲液的工作液（不要溢出），外槽加至浸没过胶底端处和电泳槽中的导热丝（总共需要约 电泳缓冲液）。如果电泳仪与预制胶不匹配，则可以自行配制 胶，配方及操作可参见相关资料。两端平行地拔出梳子，在第一道泳道加入 蛋白质 ，第二道泳道加入 阳性对照，第三道泳道加入 阴性对照，在其余泳道加入 变性完的样品（样品要趁热加）。安装好电泳装置，接通电源，设定电压 、时间 进行电泳。同时，配制好转印缓冲液，放预冷。电转印 电泳完后，取出预制胶。用专用铲刀从四周撬开预制胶外壳，切掉胶的加样齿孔及胶底部染犌犅犜 液线以下部分。在胶上倒一点转印缓冲液，使胶保持湿润。然后按照胶的大小，剪好膜及张滤纸，膜应比滤纸稍大。将膜放入 甲醇中浸湿，之后将滤纸和膜放入转印缓冲液中浸泡平衡 。在玻璃板上先放置两层对齐的滤纸，用玻璃棒沿一个方向轻赶气泡，用铲刀将胶取出放于滤纸上，并与滤纸对齐。夹取另两张滤纸，滴一些转印液在胶上，并使胶全部浸湿，然后将浸好的膜从一端慢慢往另一端放下，直至完全覆盖在胶上。如果发现膜与胶之间有白点，说明它们之间存在气泡，则用玻璃棒滚动将其驱赶。如果气泡太多，则取下膜，在转印液中再次浸湿，重新放置于胶上。如此反复，直至没有气泡。然后，将取出另两层滤纸整齐放于膜上，用玻璃棒驱赶气泡。“三明治”做好后，用铲刀将其转入转印槽中，注意膜的一端朝向正极。往“三明治”上倒入少量转印缓冲液，再用玻璃棒轻赶气泡。盖上盖子，接通电源，设定电压、时间 进行转印。封闭转印结束后，弃去胶和滤纸。观察 转印效率，如果膜上有清晰的 条带，说明转印效率良好，否则转印失败。将膜放入装有封闭液的平皿中，确保膜完全（至少有蛋白的区域）浸没，作用过夜或者 作用。注意与胶接触的一面朝上，以后的步骤都是这样。封闭结束，置摇床上用摇洗次，每次。一抗作用将膜放入一抗工作液中，确保膜完全浸没，室温下置摇床摇振孵育。作用完后，置摇床上用摇洗次，每次。二抗作用将膜放入标记的兔抗鼠 工作液中，确保膜完全浸没，室温下置摇床摇振孵育。孵育 后，打开化学发光成像仪进行预热。孵育完后，置摇床上用摇洗次，每次。底物作用按照化学发光显色试剂盒说明书配制好化学发光底物溶液（至少），混合均匀。将膜放置在一干净平皿中，将底物溶液滴加到膜的表面上，作用 。化学发光按照倍于膜的大小剪一块保鲜膜，并将其展平放于桌上。底物作用完后，将膜取出。再将膜平放在保鲜膜中间位置，拿起保鲜膜的一边，沿膜的一边折起，覆盖在膜上，再将周边的保鲜膜稍微折叠，即可放入化学发光成像仪中或通过光胶片曝光。一般情况曝光 即可。若条带太浅，则需要增加曝光时间；相反，则应减少曝光时间，直至效果最佳。注意，每次都要以图片格式保存好照片，以便判定结果。结果判定 在阳性对照和阴性对照均成立的条件下，才可判定其余样品的结果。阳性结果：曝光照片上的样品泳道出现三条特异性黑色条带，且对比胶上的蛋白质 分析条带大小在 之间，则判定为疯牛病阳性。阴性结果：曝光照片上的样品泳道没有特异性黑色条带，或者有个别杂条带，但对比胶上的蛋白质 分析条带大小不在 之间，则判定为疯牛病阴性。犌犅犜 综合判定 临床无明显特征性症状或判定为疑似的易感动物，经（免疫组织化学方法）或者（免疫印迹方法）检测出牛海绵状脑病病原，则可判定为感染牛海绵状脑病。免疫组织化学方法诊断时应同时使用组织病理染色法予以辅助确诊。免疫印迹方法诊断时，如果样品适合进行组织病理染色，那么也应同时使用组织病理染色法予以辅助确诊。犌犅犜 附录犃（规范性附录）犎犈组织病理染色法试剂配制犃 中性福尔马林固定液犃 配方氯化钠 蒸馏水 甲醛 犃 配法把以上材料混匀溶解即可使用。犃 苏木素染色液犃 配方苏木精 无水乙醇 蒸馏水 氧化汞 冰乙酸钾明矾 犃 配法先将苏木精溶于无水乙醇，然后将钾明矾和蒸馏水煮沸溶化，去火并迅速加入苏木精无水乙醇溶液中，立即加入氧化汞并煮沸，迅速冷却后加入冰乙酸，过滤后使用。犃 盐酸酒精在 的 或 酒精中加入的浓盐酸。犃 饱和碳酸锂水溶液碳酸锂加 蒸馏水，充分溶解。犃 酒精伊红溶液伊红 加入 酒精中溶解。犌犅犜 附录犅（规范性附录）免疫组织化学方法试剂配制犅 蛋白酶犓缓冲液盐酸三羟甲基氨基甲烷（，）氯化钙（）加蒸馏水至 犅 蛋白酶犓工作液使用前在蛋白酶缓冲液中加入 蛋白酶母液（蒸馏水配制，浓度为 ），使其工作浓度达。犅 高压缓冲液 柠檬酸钠 柠檬酸 煮沸的蒸馏水 配制时，先将蒸馏水煮沸，然后加入 柠檬酸钠和 柠檬酸混匀即可。犅 双氧水甲醇（使用前犿 犻 狀配制）甲醇 双氧水（）犅 犿狅 犾犔犘犅犛（狆犎）氯化钠氯化钾 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 加水 溶解，用浓盐酸调值到，加水至。犅 正常猪血清 （）正常猪血清 犅 一抗工作液一抗为商品化的鼠抗牛朊蛋白单克隆抗体，用 （）稀释单抗，使其工作浓度达到。犌犅犜 附录犆（规范性附录）免疫印迹方法试剂配制犆 匀浆缓冲液盐酸三羟甲基氨基甲烷（）氯化钠 脱氧胆酸钠 乙二胺四乙酸 充分溶解混匀即可使用，溶解不充分时可加热。可在下保存数周。犆 蛋白酶犓溶液盐酸三羟甲基氨基甲烷（）氯化钙 蛋白酶犆 消化阻止液 苯甲基磺酰氟，溶于 异丙醇，使其浓度为 。使用时的工作浓度约为。配好后应分装保存在。或者用市场上其他的酶阻止液，按照说明书配制使用即可。犆 上样缓冲液 的配方：盐酸三羟甲基氨基甲烷（）甘油 巯基乙醇 溴酚蓝蒸馏水 使用时取份上样缓冲液，加蒸馏水份，并充分混匀。可在下保存数周。犆 犜犅犛犜氯化钠氯化钾 三羟甲基氨基甲烷 犌犅犜 加蒸馏水至 溶解，加浓盐酸调值至（大约需要 浓盐酸），后加蒸馏水定容至 ，最后加入 。犆 转印缓冲液三羟甲基氨基甲烷 甘氨酸 加蒸馏水溶解至 ，再加 甲醇，用前放置预冷。犆 封闭液牛血清白蛋白 充分溶解即可使用。犆 一抗工作液一抗为商品化的鼠抗牛朊蛋白单克隆抗体（也能与痒病病原结合），用含牛血清白蛋白的溶液稀释单抗，使其工作浓度达到。犆 标记犎犚犘的兔抗鼠犐 犵犌工作液用含牛血清白蛋白的溶液稀释抗体，使其工作浓度达到。犆 阳性对照取免疫组化方法验证为痒病阳性的脑闩部组织 ，按照 的要求进行匀浆、离心处理，并以每管 分装于 离心管中，冷冻保存待用。制作过程中的生物安全要求见 规定。犆 阴性对照取免疫组化方法验证为痒病阴性的脑闩部组织 ，按照 的要求进行匀浆、离心处理，并以每管 分装于 离心管中，冷冻保存待用。犌犅犜 参考文献世界动物卫生组织陆生动物诊断试验和疫苗手册英国 疯牛病参考实验室诊断手册犌犅犜