低共熔溶剂提取小球藻碳水化合物及提取液抗氧化性研究.pdf

韶关学院学报自然科学Journal of Shaoguan UniversityNatural Science2023 年 9 月第 44 卷第 9 期Sep.2023Vol.44No.9低共熔溶剂提取小球藻碳水化合物及提取液抗氧化性研究陆伟东1，李炜康1，肖仔君2（1.韶关学院 化学与土木工程学院，广东 韶关 512005；2.韶关学院 食品学院，广东 韶关 512005）摘要：制备了 11 种低共熔溶剂（DES）并用于小球藻碳水化合物的提取.考查了提取温度、时间和加水量对 DES提取小球藻碳水化合物的影响并测定了提取液的抗氧化性.结果表明，氯化胆碱/草酸（11，摩尔比）DES 对小球藻碳水化合物提取率最高，为 81.30%.提高提取温度和增加提取时间均可以显著提高提取率.在小球藻 DES 提取液质量浓度为 0.2 mgmL-1时，其超氧化物的清除率为 97.56%.当小球藻 DES 提取液质量浓度为 3.2 mgmL-1时，其羟基的清除率为 93.38%.DES 提取液的抗氧化性显著高于相同质量浓度下水提取液和抗坏血酸的抗氧化性.关键词：低共熔溶剂；小球藻；碳水化合物；抗氧化性中图分类号：O69 文献标志码：A 文章编号：1007-5348（2023）09-0041-05小球藻（Chlorella sp.）是一类单细胞微生物.小球藻能利用阳光和 CO2进行光合作用，合成碳水化合物、蛋白质、脂肪和色素并释放出 O21.与高等植物相比，小球藻具有生长速度快、碳水化合物产率高、可在废水和荒漠地培养等优点2.小球藻碳水化合物是制备生物乙醇的理想原料3.因此，近年来废水培养小球藻及提取小球藻碳水化合物是生物燃料领域的研究热点4.目前，微藻碳水化合物提取方法主要有：硫酸溶液提取法5，微波、超声、臭氧辅助盐酸溶液提取法6-8，高压放电辅助溶剂提取法9-10，离子液体提取法等11.与挥发性有机溶剂相比，离子液体具有低挥发性、高选择性和性质可调等优点.但是离子液体的制备过程复杂，且大多存在生物毒性.低共熔溶剂（Deep eutectic solvents，DES）是一类由氢键给体和氢键受体按一定的化学计量比组成的二组分或者三组分的凝固点明显低于各个组分纯物质熔点的低共熔混合物.DES 具有与离子液体相似的优点，同时 DES 的制备过程简单、100%原子经济性、生物相容性也高于离子液体.因此，DES 在生物质预处理及物质提取与分离12、绿色化学13、药物溶解14等领域展现出独特优势.如在微藻生物质预处理辅助油脂提取方面，浙江大学课题组研究了 DES 辅助水热法提取微藻油脂，证实 DES 能促进微藻生物质解聚和溶解，进而提高油脂提取效率15.笔者报道了用多种 DES预处理小球藻生物质强化小球藻油脂提取，探究了 DES 预处理强化小球藻油脂提取的微观机理16.但是，适用于小球藻碳水化合物提取的 DES、DES 提取小球藻碳水化合的影响因素及其机理和提取液抗氧化性尚未清楚.笔者将从适用于小球藻碳水化合物提取的 DES 筛选入手，考查提取的影响因素及其原因，并对 DES 提取液的抗氧化性进行测定.为进一步开发 DES 在小球藻代谢物提取的应用提供技术支撑，也为DES 在其他生物活性物质的提取与分离提供借鉴.1材料与方法1.1主要材料与仪器主要材料有小球藻粉（购自青岛科海生物有限公司）、氯化胆碱、草酸、葡萄糖、抗化血酸等，所用试剂均为分析纯.主要仪器有高速离心机（湖南湘仪）和紫外可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司）.收稿日期 2023-02-20基金项目 广东省自然科学基金面上项目“低共熔溶剂（DES）预处理微藻辅助油脂提取过程微藻内容物溶出行为的构效关系及其机理研 究”（2020A151501404）；广东省普通高校重点科研平台项目“天然低共熔溶剂（NADES）提取丹霞铁皮石斛叶黄酮类化合物的构效关系及化学机理研究”（2021ZDZX4059）作者简介 陆伟东（1980-），男，广东清远人，韶关学院化学与土木工程学院副教授，博士；研究方向：化工与环境保护.42韶关学院学报自然科学2023 年1.2实验方法（1）DES 制备：分别将氢键供体和氢键受体按照一定摩尔比加入圆底烧瓶中，在 80 恒温加热搅拌 2 h 左右，得到无色透明液体，冷却至室温.所有的样品使用前均先在 80 的真空干燥箱中干燥 24 h.（2）DES 提取小球藻碳水化合物：精准称量 0.1 g 藻粉，按一定料液比加入 DES 并置于水浴锅中加热.提取完毕后混合液离心（5 000 rmin-1，10 min）得上清液，上清液用于碳水化合物含量的测定.（3）小球藻及 DES 提取液中碳水化合物含量测定：小球藻及 DES 提取液中碳水化合物含量测定参考Zhao 等的实验方法并作了一定的修改7.具体步骤为：称取 20 mg 左右小球藻粉，放置于 10 mL 的玻璃离心管中，加入 5 mL 0.5 molL-1的硫酸溶液，100 条件下水解 4 h，冷却至室温后离心（3 500 rmin-1，5 min），重复上述步骤 3 次，所得上清液定容，用于小球藻总碳水化合物含量测定.碳水化合物含量测定过程为：取样品，加入苯酚和浓硫酸溶液进行反应，显色后于 490 nm 测定吸光度，计算出样品碳水化合物含量.碳水化合物提取率为小球藻 DES 提取液中碳水化合物含量与小球藻样品中碳水化合物含量的百分比.（4）抗氧化性测定：小球藻 DES 提取液、小球藻水提取液和抗坏血酸的超氧化物清除能力和羟基的清除能力测定参考孙利芹的实验方法进行17.2结果与分析2.1DES 筛选DES 的结构决定了其物理化学性质，DES 的物理化学性质显著影响其对小球藻碳水化合物提取效率.笔者合成了 11 种 DES 并将其用于小球藻碳水化合物提取.同时作为对比，还测定了水和 1 molL-1草酸溶液提取小球藻碳水化合物的提取率.结果如图 1 所示，DES 对小球藻碳水化合物的提取率在 36.79%79.41%之间.其中氯化胆碱/草酸（11，摩尔比，下同）对小球藻碳水化合物提取率最高（79.41%），高于相同提取条件下水的提取率（40.37%）和1 molL-1草酸水溶液的提取率（50.44%）.其主要原因可能为氯化胆碱/草酸（11）是强酸性 DES 且能与小球藻细胞壁中的纤维素和半纤维素形成氢键，降低了纤维素和半纤维的键能，有利于小球藻细胞壁中的纤维素和半纤维素水解16.因此，在后续实验中采用氯化胆碱/草酸（11）来提取小球藻碳水化合物.2.2提取温度对碳水化合物提取率的影响温度能显著影响化学反应速率和物质扩散速率.固定反应时间为 60 min，液固比 201（v/m，下同），分别测定温度为 30、40、50、60、70、80 时小球藻碳水化合物提取率.由图 2 可以看出，随着提取温度升高，DES 对小球藻碳水化合物的提取率显著增加.提取温度为 30 时，提取率为 51.60%.当提取温度升至 80 时，碳水化合物的提取率为 81.19%，提高了约 30%.其主要原因是随着提取温度的增加，小球藻细胞壁纤维素和半纤维素等碳水化合物快速水解.同时，温度的提高也有利于小球藻细胞内碳水化合物向溶剂扩散18.由于提取温度也是影响小球藻胞内物质稳定性和生物活性的主要因素，且提取温度是小球藻生物炼制能耗的主要部分.因此，笔者不考查更高提取温度，后续实验的提取温度采用 80 .溶剂编号分别代表：1.水；2.薄荷醇/十二醇（13）；3.氯化胆碱/尿素（11）；4.氯化胆碱/尿素（15）；5.氯化胆碱/甘油（11）；6.氯化胆碱/甘油（21）；7.氯化胆碱/草酸（11）；8.氯化胆碱/草酸（21）；9.氯化胆碱/草酸（31）；10.氯化胆碱/乳酸（11）；11.氯化胆碱/乳酸（12）；12.氯化胆碱/乳酸（13）；13.草酸溶液（1 molL-1）.图 1不同 DES 对碳水化合物的提取率图 2提取温度对提取率的影响43第 9 期陆伟东，等：低共熔溶剂提取小球藻碳水化合物及提取液抗氧化性研究2.3提取时间对碳水化合物提取率的影响固定提取温度 80，液固比 201，考查不同提取时间（10、20、30、40、50、60 min）对 DES 提取小球藻碳水化合物效率的影响.由图 3 可知，随着提取时间从 10 min增加至 30 min，DES 对小球藻碳水化合物的提取率显著增加（从 47.04%增加至 72.47%）.此结果与 Yirgu 等采用微波辅助稀盐酸提取栅藻（Scenedesmus sp.）碳水化合物相似6.其主要原因是开始提取阶段，小球藻细胞碳水化合物含量与 DES 相中碳水化合物浓度存在较大差异，有利于提取.当提取时间超过 30 min 后再进一步延长提取时间，DES 对小球藻碳水化合物提取率增加不显著.主要原因是经过较长提取时间后，DES 相中碳水化合物的浓度增加明显，固液相碳水化合物的浓度差显著变小，碳水化合物向DES 相扩散的速率也显著降低19.综合考虑提取率和提取成本，30 min 为较佳的提取时间.2.4含水量对碳水化合物提取率的影响氯化胆碱/草酸（11）在常温下黏度较高，不利于物质扩散.因此，固定提取温度 80，提取时间 60 min，液固比 201，通过在氯化胆碱/草酸（11）中加入不同质量分数的蒸馏水（5%、10%、15%和 20%），考查蒸馏水的加入量对小球藻碳水化合物提取率的影响.作为对照，同时也测定未加水的 DES 对小球藻碳水化合物的提取率.由图 4 可以看出，未加水的氯化胆碱/草酸（11）对小球藻碳水化合物的提取率为 79.40%，蒸馏水添加量为 5%时，提取率增加至 81.13%.当蒸馏水的添加量超过 5%后，碳水化合物的提取率显著下降，当蒸馏水的添加量增加至 20%时，碳水化合物的提取率仅为 66.06%.其主要原因是少量的蒸馏水加入可以降低 DES 的黏度，有利于碳水化合物从藻细胞扩散到溶液相.但是，过量的水加入 DES，会破坏 DES 的氢键结构，不利于 DES 形成超分子结构并与藻细胞壁的纤维素、半纤维素形成氢键提高藻细胞壁的通透性20.2.5超氧化物的清除能力超氧化物是含有超氧离子（O2-）的一类化合物.它是一种活性氧，若生物体内 O2-产生过量或体内过氧化物歧化酶活力下降，都将会给机体造成损伤21.采用邻苯三酚在碱性条件下产生的 O2-，并测定小球藻 DES 提取液、小球藻水提取液和抗坏血酸水溶液对 O2-的清除能力，结果如图 5 所示.可以看出，随着小球藻 DES 提取液质量浓度提高，其超氧化物清除率快速增加，当小球藻 DES 提取液为 0.2 mgmL-1时，超氧化物清除率为 97.56%，继续增加小球藻 DES 提取液质量浓度，超氧化物清除率变化不显著.此外还可以看出，小球藻 DES 提取液的超氧化物清除率均比相同质量浓度下的小球藻水提取液和抗坏血酸水溶液的超氧化物清除率高.其主要原因是 DES 提取液对小球藻碳水化合物的提取率要显著高于水的提取率，而小球藻多糖中存在大量的羟基和硫酸基团，可与 O2-反应，从而清除 O2-21.图 3提取时间对提取率的影响图 4加水量对 DES 提取碳水化合物效率的影响图 5超氧化物的清除率44韶关学院学报自然科学2023 年2.6羟基的清除能力羟基自由基（OH）具有极高的氧化活性.它能引起生物体的病变.因此，OH 清除率常被用于评价抗氧化剂的抗氧化性21-22.分别对不同质量浓度的小球藻 DES 提取液和抗坏血酸的清除自由基效率进行了测定，结果如图6 所示.可以看出，当小球藻 DES 提取液的质量浓度低于0.5 mgmL-1时，提取液对羟基自由基清除率呈缓慢增加的趋势，且小球藻 DES 提取液对羟基自由基的清除率与同质量浓度的抗坏血酸对羟基自由基的清除率相当.当小球藻DES 提取液的质量浓度高于 0.5 mgmL-1时，提取液对羟基自由基清除率显著增加，小球藻 DES 提取液对羟基自由基的清除率显著高于同质量浓度的抗坏血酸对羟基自由基的清除率.当小球藻 DES 提取质量液浓度为 3.2 mgmL-1时，其对羟基自由基的清除率高达 93.38%，同质量浓度的抗坏血酸对羟基自由基的清除率仅为 28.14%.3结论当提取温度为 80，提取时间为 60 min 和水添加量为 5%时，氯化胆碱/草酸（11）低共熔溶剂对小球藻碳水化合物的提取率达到 81.3%，显著高于水提法的提取率（40.37%）.此外，小球藻氯化胆碱/草酸（11）提取液的超氧化物清除能力和自由基清除能力也显著高于同质量浓度的小球藻水提取液和抗坏血酸的超氧化物清除能力和羟基清除能力.但是，由于低共熔溶剂的沸点与常规溶剂相比较高，回收存在一定的困难，因此仍需对目标化合物分离与纯化进行进一步的研究.参考文献：1 TOUNSI L，HENTATI F，HLIMA H B，et al.Microalgae as feedstock for bioactive polysaccharidesJ.International Journal of Biological Macromolecules，2022，221：1238-1250.2 DEBNATH C，BANDYOPADHYAY T K，BHUNIA B，et al.Microalgae：Sustainable resource of carbohydrates in third-gen-eration biofuel productionJ.Renewable and Sustainable Energy Reviews，2021，150：111464.3 DE CARVALHO SILVELLO M A，GONALVES I S，AZAMBUJA S P H，et al.Microalgae-based carbohydrates：A green innovative source of bioenergyJ.Bioresource Technology，2022，344：126304.4 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intensively studied.The results showed that maximum carbohydrate extraction rate（81.30%）was achieved by using DES formed by choline chloride/oxalic acid（11）as extraction solvent.In addition,significant enhanced carbohydrate extraction rate could be obtained by increasing extraction temperature and extending the extraction time.Finally,the removal rate of 97.56%was achieved with 0.2 mgmL-1 DES extract.The removal rate of 93.38%was obtained with 3.2 mgmL-1 DES extract,indicating that the antioxidant resistance of DES extract was significantly higher than that of water extract and ascorbic acid of the same concentration.Key words:deep eutectic solvents;Chlorella sp.;carbohydrate;resistance to oxidation（责任编辑：黄玫恺）