植物分子系统学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA,资料与植物系统学,植物分子系统学,1,一、植物分子系统学的概念,二、植物系统学常用的,DNA,资料,三、植物系统学常用的,DNA,分析技术,四、植物分子系统学应注意的问题,目 录,2,一、植物分子系统学的概念,1,生物系统分类技术的进展历程,1.1,大形态时期,(,公元前,400,年至公元,1700,年,),根据易于识别的宏观形态特征来鉴别生物，使生物有一定的名称。这一时期又称术语描述期。,1.2,小形态时期,(,公元,1700,1860,年,),主要是新的形态学，如解剖学、胚胎学的建立和发展时期。,1.3,进化论时期,(,公元,1860,1900,年,),进化论推动了系统学研究的发展，在系统发育的基础上创立了很多分类系统。,1.4,细胞遗传学时期,(,公元,1900,1960,年,),利用细胞遗传学的丰富资料和改写系统分类，进入细胞水平的研究。本时期又称实验生物学时期。细胞生物学和植物系统学结合产生的植物细胞分类学，使我们能在染色体水平上更好地理解植物的分类与进化，特别是物种分化问题。,1.5,分子生物学时期,(1970,年至今,),分子生物学的迅速发展，给生物系统分类以巨大的推动。利用,DNA,信息来探讨植物系统学，形成了植物学研究的一个新的热点,植物分子系统学。,3,2,植物分子系统学的概念,植物分子系统学是,分子生物学,和,植物系统学,交叉形成的一门学科，它利用分子生物学的各种实验手段，获取各类分子性状，以探讨植物的,分类,，类群之间的,系统发育关系,，以及,进化,的过程和机制。,一、植物分子系统学的概念,4,1,核,DNA,资料与植物系统学,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,3,线粒体,DNA,资料与植物系统学,二、植物系统学常用的,DNA,资料,5,1.1 rRNA,基因,(rDNA),1,核,DNA,资料与植物系统学,rDNA,的基本结构,高度重复序列 多基因家族,每个重复单位长约,7-13kb,，大多为,9-10kb,6,1,核,DNA,资料与植物系统学,rDNA,的变异,拷贝数的变化,植物中,rDNA,重复单位的拷贝数在种间、种内甚至同一居群内的不同个体之间变化很大，其差异可达数十倍。,蚕豆，不同居群间，其拷贝数的变化范围在,500-44000,。,长度变异,rDNA,重复单位的编码区几乎无长度变异。,长度变异主要存在于,ITS1,、,ITS2,和,IGS,上。,导致差异的原因是,IGS,的序列中部存在着亚重复序列，其长度为,100-200bp,，这种亚重复序列在物种间还存在拷贝数的差异。,序列差异,rDNA,的序列在不同生物类群间存在不同的保守性，在高等植物中，不同纲、目之间的同源率可达,90%,以上。在低等植物中，序列同源性仅在,80%,左右，在编码区内的不同区域的同源性也有区别。,序列的差异主要表现在,ITS1,、,ITS2,和,IGS,上，其中,IGS,差异更大。如豌豆和蚕豆的,ITS1,序列存在,16-50%,的差异。,7,在高等植物中，,rDNA,的编码区序列高度保守,(,不同纲、目间的同源率可达,90%,以上,),，序列差异主要表现在,ITS,、,ETS,及,IGS,等非编码区上。,rDNA,的编码区,(18S,、,5.8S,及,26S),序列一般用于高级阶元的系统发育研究，而非编码区,(ITS,、,ETS,及,IGS),序列常用于较低分类阶元的系统学研究。,1,核,DNA,资料与植物系统学,8,rDNA,资料的植物系统学应用,A,18S,基因,序列长约,1850bp,。,18S,基因序列分析对揭示植物高等级分类群间的系统发育关系具有重要意义，进化速率慢，,适用于科级以上水平的研究,，,1998,年以前已经成功的运用到藻类、藓类、蕨类、裸子植物、低等金缕梅类和毛茛类、单子叶植物等的系统学研究。,Nickrent,和,Soltis(1995),的研究表明，,18S,基因对于被子植物内高级分类水平上,(,科及科以上,),的系统发育研究可提供较多的信息，,其序列变异程度尤其适于探讨被子植物乃至种子植物内部的深度系统发育分支间的关系,。,Chaw,等,(1997),运用,18S,基因探讨了裸子植物的分子系统发育及种子植物的进化问题，结论支持裸子植物为单系群。,Soltis,等,(1997),选用了,233,个种代表被子植物的所有纲，用,18S,基因研究支持了木兰纲是现有被子植物中最原始的类群。,由于在不同类群间序列的变异程度有所差异，,18S,基因有时也可用于亚科或属间关系的重建,，如檀香目及其它寄生植物，其,18S,基因的进化速率明显快于在其它被子植物中的速度。,1,核,DNA,资料与植物系统学,9,B,ITS,序列,ITS1,的长度为,187-298bp,，,ITS2,的长度为,187-252bp,，,ITS,可能是分子系统学研究中应用最为广泛的基因之一。,ITS,序列在裸子植物中变异很大，尤其是长度变异非常显著，因此一般认为,ITS,不适用于裸子植物的系统发育研究,。但在被子植物中，,ITS,区由于,序列短,(600-700bp),、,两端连接高度保守区,、,拷贝数多,、,长度保守,、,一致进化,、,进化速率较快,等特点，,适用于科内，尤其是近缘属间及种间甚至居群间关系的研究,。,屈良鹄和陈月琴,(1999),通过对不同生物类群的,ITS,序列,(,自生物学数据库,),的比较得出，被子植物大多数科属其,ITS,序列的种间差异值为,1.2-10.2%,，属间差异值为,9.6-28.8%,，这对系统发育研究来说都是较合适的范围。另外，,ITS,在一些起源古老,(,如,Viburnum,、,Nothofagus,及,Winteraceae,的一些属,),或世代较长的植物类群,(,如木本竹子,),中的变异较低，也为研究那些间隔区进化速度很慢的古老类群间的关系和长世代类群内较高阶元的系统重建提供了可能性。,1,核,DNA,资料与植物系统学,10,通常，,ITS,在研究属内种间和较近的族间、属间关系时都表现出较高的趋异率和信息位点百分率，为类群内部的系统重建提供了较好的支持。另外，,ITS,序列对于揭示异域或间断分布居群间的关系也具有潜力。,ITS,不仅可以解决科、亚科、族、属、组内的系统发育和分类问题，而且可以用于重建多倍体复合体的网状进化关系，探讨异源多倍体的起源过程。,ITS,应用于植物系统学研究的缺点是序列短，能够提供的性状数量有限，因此最好将其与其它来源的资料结合起来构建较好支持的系统树。,1,核,DNA,资料与植物系统学,11,1,核,DNA,资料与植物系统学,C,ETS,及,IGS,序列,rDNA,重复单位中的外转录间隔区,ETS,位于,18S,基因的上游，其长度在不同类群间的变异较大，一般在,0.8-1.1kb,之间，虽然,ETS,的进化速率与,ITS,相似，甚至更快，但由于上游与高变的,IGS,相连，难以找到合适的通用引物扩增整个区域，故用于系统学研究的例子较少，一些作者认为这一片段对于那些仅靠,ITS,片段尚不能提供足够变异的年轻分支内的研究可给予一定的帮助。,位于,rDNA,重复序列间的非编码区,NTS,或称基因间区,IGS,，是,rDNA,中进化最快的片段之一，推测在近缘类群间的系统学研究、杂交研究及居群遗传学研究上具有一定的应用潜力。,12,1,核,DNA,资料与植物系统学,随着探索其它核基因组序列在植物系统发育重建研究中应用的深入，如,waxy,内含子、多聚半乳糖醛酸酶、谷氨酰胺合成酶的内含子及外显子、,rpb2,、乙醇脱氢酶、光敏色素、组蛋白,H3,内含子和小热激蛋白编码基因等等，为针对特定的系统发育问题的研究提供了更多的可供选择的,DNA,序列,(,但多为多基因家族,),。,查尔酮合成酶,(chalcone synthase,，,CHS),是植物类黄酮物质合成途径的关键酶，,CHS,基因是一个较大的基因家族，其编码区比较保守，长约,1.2kb,，,科之间的同源性一般在,80%,以上,。,王金玲等,(2000),认为,CHS,基因可以用于科以下分类等级的系统关系研究,。,1.2,其它核基因组序列,13,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,2.1,叶绿体基因组的结构,cpDNA,为,闭环双链,DNA,长度一般为,120-220kb,多在,120-160kb,之间 单子叶植物,111-182kb,双子叶植物,117-165kb,长度变异主要由两个,反向重复序列,(IR),引起。,IR,长约,22-25kb,，其上主要为一些,rRNA,基因，重复区内基因完全相同，但序列相反。,两个反向重复序列将整个,cpDNA,分为一个,大单拷贝区,(LSC,，长约,81-87kb,),和一个,小单拷贝区,(SSC,，长约,18-20kb,),。,14,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,2.2,叶绿体基因组的变异,任何两种植物之间至少有,30%,的同源性，亲缘关系越近同源性越高。,cpDNA,主要变异表现在以下方面：,倒位与重排：,植物,cpDNA,中存在着广泛的重排现象。天竺葵、桔梗科和一些豆科植物的,cpDNA,的重排现象频繁。豆科植物中广泛存在着一个,50kb,的倒位现象，地钱及苔藓植物与烟草的,cpDNA,的差异也表现在,30kb,的倒位。而且，倒位的发生使重排率更为加大。,插入或缺失：,主要是,IR,缺失、基因或内含子缺失、非编码区的插入或缺失。在豆科及裸子植物中的松柏类等一些植物中缺失反向重复序列,IR,。烟草和地钱中的三个内含子在水稻中缺失。在非编码区的插入或缺失经常发生，而在编码区插入或缺失常是,3bp,或,3,的倍数，而并不打破其原来的阅读框架。,序列变异：,cpDNA,相当保守，进化速率平均每年每个位点约,0.2-1.010,-9,，仅为核基因组的,1/5,。而在编码蛋白质的基因中，碱基置换率与核基因极为相似，显示出同样的自然选择压的结果。一般来说，非编码区的突变率要明显高于编码区。在,cpDNA,中，不同区域的突变率也有差异，,LSC,的突变率高于,SSC,。另外还存在一些突变的热点区。,15,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,植物,cpDNA,因具有下列特性，已成为分子系统学研究的焦点：,基因组较小，但包含大量的,DNA,成分；,拷贝数目多，有利于提取与分离；,在分子水平上的差异明显，为比较进化研究提供了基本的信息支持；,序列资料全面，许多,cpDNA,基因在许多植物中已被测定；,相对保守保证了分类群之间的可比性，一个,cpDNA,探针可用于所有分类群的比较研究；,编码区和非编码区序列进化速率相差较大，适于不同分类阶元的系统发育研究。,cpDNA,有其独立的进化路线，可以不依赖其它任何数据即可构建系统树。,但由于,cpDNA,是单亲遗传，因此并不能解释所有的系统发育问题，如研究类群间的杂交或渐渗现象。,2.3,cpDNA,在植物系统学的应用,16,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,2.3.1,编码基因,除,rbc,L,基因外，越来越多的,cpDNA,编码基因,(,如,mat,K,、,ndh,F,、,atp,B,等,),被广泛应用于不同科、目乃至整个被子植物的系统发育研究中。,17,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,A,rbc,L,基因,编码,1,，,5-,二磷酸核酮糖羧化酶,/,氧化酶大亚基，,位于,cpDNA,的大单拷贝区，长约,1400bp,。,随着对,rbc,L,基因研究的深入，如结构、功能、进化速率及其在植物不同分类阶元中的系统学意义等等，,rbc,L,成为植物分子系统学研究中应用最普遍的基因之一,。,虽然,rbc,L,基因在不同植物类群中的进化速率有着较大的差异，但总的来说相对保守,(,如烟草和水稻的,rbc,L,基因的核苷酸相似性为,93%),，为植物较高分类阶元的系统发育历史的重建研究提供了一重要的性状来源，并得到了很好的启发性的研究结果。迄今为止，,rbc,L,基因序列已用于许多分类群的系统发育研究，从科内,(,多为远缘属间,),到有花植物主要谱系间，甚至于整个蕨类、种子植物谱系间的关系,。,18,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,与进化速率快的基因相比，,rbc,L,基因与其它进化较慢的,cpDNA,序列常被广泛应用于较远类群的系统学研究中，但用,DNA,序列研究远缘相关类群常会遇到以下两个问题：,(1),所选编码序列的各核苷酸位点的替代速率不一致。如,rbc,L,基因的同义替代率比非同义替代率大约高,15,倍，但这一缺陷可以将,DNA,序列翻译成蛋白，进而比较其氨基酸序列的方法予以弥补。,(2),在主要植物分支间关系的研究中，许多关键问题常会涉及到早期植物在一较短的时间里发生了怎样的分化，而进化慢的基因相对于进化快的基因在这一分化时期未能发生足够的碱基替代，故对所发生的分支进化不能提供足够的重建信息，但将分子与形态数据结合起来分析，会对系统重建研究有所帮助。,Morhar,等（,1994,）研究了蔷薇科植物,rbc,L,序列变异在系统学和进化上的意义，证实蔷薇科内建立苹果亚科的合理性。汪小全等（,1997,）运用,PCR,方法分别从松科,8,属、,9,种植物中扩增出长约,2550bp,的,cpDNA,片段（包括,rbc,L,、,trn,R,及基因间的非编码区），选用,18,种限制性内切酶进行酶切分析，揭示了松科植物系统发育的分子生物学证据。俸宇星等（,1998,）利用,rbc,L,基因序列分析对连香树科和交让木科的系统位置重新进行了评价。陈之瑞等（,1998,）用,rbc,L,基因序列确定了马尾树科的系统地位。,19,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,B,mat,K,基因,mat,K(,orf,K),基因位于叶绿体,trn,K,基因的内含子中，长约,1550bp,，编码一种参与,RNA,转录体中,II,型内含子剪切的成熟酶，是叶绿体基因组的蛋白编码区中进化最快的基因之一。,20,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,与其它序列相比，,mat,K,基因的进化速率大约是,rbc,L,的,2-3,倍；,ndh,F,序列的,1.3,倍；但却慢于,ITS,序列，一般是,ITS,序列的一半左右。,在科级、属级水平，,mat,K,序列分析为研究类群内部的系统重建提供了较多的信息和高的支持率。在某些类群中，,mat,K,序列的核苷酸变化也为种间、种下的系统研究提供了一定的价值。,Soltis,等（,1996,）利用,mat,K,和,rab,L,基因序列对虎耳草属进行了系统发育重建，用,mat,K,序列构建的系统树与用,rab,L,基因序列构建的系统树高度一致。,Johnson,和,Soltis,（,1995,）认为，,mat,K,的序列变异中转换和颠换的频率、密码子,3,个位置的变异频率没有严重的偏高。由于,mat,K,序列的变异较均一，在构建系统树时不必对不同类型的变异进行加权，极大地增强了分子系统树的可靠性。,21,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,C,trn,基因,trn,T-,trn,L-,trn,F,基因间三段非编码区，由于不受功能的限制，其进化速率大于功能编码区，目前已被广泛用于植物系统学研究。其三段非编码区所在位置及通用扩增引物设计如图所示。,Germano,等（,1990,）利用,trn,F-,trn,L,内间隔区和,ITS,序列进行白云杉、黑云杉和红云杉的品种鉴定。在被子植物科下水平的系统学研究中，,trn,L-,trn,F,的使用频率较高。,22,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,D,ndh,F,基因,ndh,F,基因位于叶绿体基因组的小单拷贝区，编码假定的叶绿体,NADH,脱氢酶的一个亚基，在烟草中长,2223bp,，但在不同类群间由于插入,/,缺失突变常引起长度上的变异。,Randall,等（,1997,）在凤梨科植物系统学研究中采用的模板扩增和测序引物如图所示。,研究发现，,ndh,F,基因长度一般是,rbc,L,的,1.5,倍，但核苷酸替代速率约是,rbc,L,的,2,倍，因此能,比,rbc,L,基因更好地解决科内系统关系的研究,。另外，一些学者也成功地,利用,ndh,F,基因阐述了一些类群在科间水平的系统发育关系,。,23,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,E,atp,B,基因,atp,B,基因位于叶绿体基因组的大单拷贝区，编码,ATP,合成酶,(,ATP,synthase),的,亚基，两边毗邻,atp,E,和,rbc,L,基因。,atp,B,基因的许多特性使其在较高分类阶元的比较序列研究中具有一定的价值,，如其长度一般为,1497bp,，既容易被测序，又可以提供足够的潜在的系统发育信息。另外，此基因序列较为保守，在玉米和烟草间的,Ks,值为,0.62,，对于,rbc,L,基因则为,0.63,，由此显示，,atp,B,与,rbc,L,基因的进化速率非常相似。,24,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,2.3.2 cpDNA,非编码区,近年来，,cpDNA,非编码区,(,包括内含子和基因间区,),序列的测定在植物不同分类阶元的系统研究中被越来越广泛地应用起来。与许多编码基因相比，这些非编码区因其在功能上的限制较少，无论是在核酸替代还是插入,/,缺失突变的积累上，都表现出更快的进化速率；与相当长度的编码区片段相比，这些非编码区能提供更多的具系统学意义的信息位点，故多用于较低分类阶元及近期分化类群间的系统学研究中。,cpDNA,内含子：,rpL,16,内含子，,rps,16,内含子，,rpoC,1,内含子,cpDNA,基因间区：,trn,L-F,非编码区，,Trn,T-,trn,L,间区,25,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,A,cpDNA,内含子,内含子位于编码基因的内部，其转录序列在转录后加工过程中被切除，而不参加翻译过程。在烟草叶绿体基因组的,79,个假定蛋白编码区和,30,个,tRNA,基因中，有,18,个含有内含子，其中,6,个被内含子切断的基因是编码,tRNA,的，其余,12,位于蛋白编码基因中。,rpL,16,内含子,cpDNA,内含子,rps,16,内含子,rpoC,1,内含子,26,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,rpL,16,内含子,叶绿体中编码核糖体蛋白的,rpL,16,基因位于,cpDNA,大单拷贝区,，由两个外显子和中间一段相对较长的,II,型内含子组成。其内含子序列的差异主要体现在长度上，从地钱的,536bp,到少根紫萍的,1400bp,变化不等，但在大多数被子植物中，其长度一般为,1kb,左右。,Downie,等,(1996),通过对烟草和水稻中的,17,种叶绿体内含子的相似性比较认为，,rpL,16,是,cpDNA,中进化速率最快的内含子,；,Small,等,(1998),在对锦葵科棉属的,cpDNA(,包括,3,个内含子：,rpL,16,、,rpoC,1,和,ndhA,及,4,个基因间区：,accD,-,psaI,、,trnL,-,trnF,、,trnT,-,trnL,和,atpB,-,rbcL,),和核编码的,Adh,基因家族及,ITS,序列的比较研究中，也支持,rpL,16,内含子在,cpDNA,中相对快的进化速率,。,作为,cpDNA,中进化最快的内含子之一，,rpL,16,内含子在远缘类群间的长度变异非常明显，使得较为确定的排序几乎是不可能的，因此,rpL,16,内含子一般用于较低分类阶元或近缘类群间,(,如种间、近缘属间,),及较晚分化的类群间,(,如,0.5-2,百万年前,),的系统发育研究，但其所能提供的系统学信息都明显低于,rDNA,的,ITS,片段,。在竹子中，,rpL,16,内含子适于解决属级以上分类水平的系统发育,(,成对序列趋异范围在,0-8.2%,之间,),，与禾本科中许多其它类群相比，木本竹子,cpDNA,的编码区序列的进化速率相对较慢，因此推断,rpL,16,内含子在其它植物类群中应该更适用于较低阶元的系统分析,。,27,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,rps,16,内含子,编码核糖体蛋白,S16,的,rps,16,基因位于植物,cpDNA,大单拷贝区,，但,在某些科的代表种中部分或完全缺失，,如牛栓藤科、杜仲科、壳斗科、亚麻科及杨柳科等。该基因常被一个,II,型内含子分割为两部分，此内含子长度从,707bp,到,951bp,变化不等。,总的来说，,rps,16,内含子的进化速率与多数已报道的内含子相近，其中,rpoC,1,内含子与其最为相似。资料显示，,rps,16,内含子一般适用于较高分类阶元的系统发育研究，但其变异的大小还不足以解决属下，特别是近代分化类群的系统关系,。在木犀科，它甚至不能很好地解决族间的关系。,28,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,rpoC,1,内含子,与,E,.,coli,RNA,聚合酶,亚基同源的,rpoC,区域位于大多数被子植物叶绿体基因组的,大单拷贝区,，分为,rpoC,1,和,rpoC,2,两个基因，这两个基因与,rpoB,基因共同编码叶绿体,RNA,聚合酶的,3,个亚基，其中,在大多数被子植物中，,rpoC,1,被一内含子分割为两个部分,，但,水稻等少数植物的,rpoC,1,基因不含内含子,。,Downie,等,(1996),通过对伞形科、芹亚科的,25,个种,(7,族，,8,亚族,),及外类群的,rpoC,1,内含子序列分析，,发现,rpoC,1,内含子虽然能为外类群和,Apioideae,的远缘类群间的系统关系提供有价值的信息，但却不能为近缘分类群间的关系重建提供足够的信息,。,与,ITS,和,rpL,16,内含子相比，,rpoC,1,内含子的进化速率在本亚科远远低于前两者,(,约为,ITS,的,1/4,，,rpL,16,内含子的一半,),。,29,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,B,cpDNA,基因间区,叶绿体基因间的间区部分不参加转录翻译过程，因而在功能上的限制较少，变异较为自由，比编码基因能提供更多的系统发育信息。目前用于系统学研究的叶绿体基因间区主要有：,1),atpB,rbcL,：一般长约,900bp,，多用于科间，族间或属间；,2),trnC,-,rpoB,：长约,1200bp,，用于种及种下系统；,3),psbA,-,trnH,：长约,300bp,，其进化速率在芍药属大大快于,mat,K,基因，但稍慢于,ITS,，可用于组间及种间的发育研究；,4),accD,-,rbcL,：长度及结构变异较大，预测在较低分类阶元的系统发育分析中有一定的应用价值，如在蓼科荞麦属，其进化速率,(,包括部分,accD,5,编码区,),大约是,rbc,L,基因编码区的,5,倍，较好地解决了属内种间的系统关系。,30,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,trn,L-F,非编码区,编码转运,RNA,的,trn,L,基因位于,cpDNA,的,大单拷贝区,，中间被一长约,390-615bp,的内含子分隔为两部分，一般认为此片段序列较短，所能提供的信息性状较少，且在结构上与,trnF,基因相邻,(,两基因间有一长约,160-440bp,的基因间区,),，故,这两个非编码区序列常结合在一起被测定分析,。,资料显示，这一结合区域的进化速率与其它叶绿体的非编码区相比，并不属于较快的一类，且大大慢于,rpL,16,内含子或,trnT,2,基因间区。与,ITS,序列相比，,ITS,的替代速率平均是整个,trn,L-F,非编码区的,2-3,倍；而与,rbc,L,相比，此非编码区的进化速率则平均是,rbc,L,基因的,3,倍以上。研究表明，,这一区域在一定分类水平上适用于系统关系重建，如近缘科间、亚科间、族间或属间，但在大多数情况下，这一区域的序列变化并不足以解决种间关系,。,31,2,叶绿体,DNA,资料与植物系统学,Trn,T-,trn,L,间区,编码转运,RNA,的,trn,T,和,trn,L,基因间有一较长的基因间区,(,一般在,600-1400bp,之间,),。资料显示，,这一间区在,cpDNA,中属于分子进化速率较快的非编码区序列,。,Small,等人,(1998),在对叶绿体中的几个非编码区,(,包括,trn,T-,trn,L,间区,),和核,ITS,序列、,Adh,基因的核苷酸替代速率进行比较时发现，包括,trn,T-,trn,L,间区在内的,3,个基因间区在,PCR,扩增中或不能产生足够的测序模板或已知的扩增引物不适于测序，虽然他们用克隆的方法克服了上述问题，但大大增加了实验的工作量和复杂性，这也许也是,trn,T-,trn,L,间区虽然有较大的变异,(,在,trn,T-,trn,F,区段中变异最大,),和应用潜力却,很少被用于系统学研究,中的原因之一。,32,3,线粒体,DNA,资料与植物系统学,（,1,）,mtDNA,和,cpDNA,相似，为闭环双链,DNA,，大小约,200-2000kb,，但不同类群间大小差异很大，大多数被子植物为,300-600kb,。,（,2,）,在,mtDNA,中存在许多外源序列，如，已知的,mtDNA,中均存在着约,12kb,的,cpDNA,序列，这些外源序列一般是无功能的假基因。,（,3,）,在已知的植物,mtDNA,中都存在大的反向重复序列，其长度为,1-14kb,，不同类群间变化很大。,（,4,）,由于重组、重排、重复和丢失现象十分普遍，导致结构和基因次序变化多样。,（,5,）,在线粒体中同时存在有许多环状或线状的小质粒（,1-11kb,），它们的来源和功能尚不清楚。,（,6,）,mtDNA,中有大量的短（约,50-1000bp,）而分散的重复序列散布于整个,mtDNA,中。,（,7,）,mtDNA,的重排现象非常普遍，在已研究过的植物,mtDNA,中，基因排列都不同，甚至在亲缘关系很近的类群中仍然存在一个或多个大的倒位。,（,8,）,单个基因核苷酸序列非常保守，单个基因核苷酸置换率非常低,(,约为,cpDNA,的,1/3-1/4,，核基因组的,1/12),。,由于植物组织中,mtDNA,拷贝数低，难于提取和纯化，因此一般很少用于系统发育分析，估计在解释植物系统发育的深层分枝时会起作用。,3.1,线粒体,DNA,的结构特点,33,3,线粒体,DNA,资料与植物系统学,3.2 mtDNA,在植物系统学的应用,由于植物,mtDNA,重排率高而突变率低，拷贝数低，难于提取和纯化，限制了其在植物系统学上的应用。,利用限制性酶切式样可以分析其在低级分类群上的变异，利用其基因的低突变率可以研究高等级分类群之间的进化,。,随着对许多植物全基因组测序的完成，人们对被子植物线粒体基因组的认识也在增加，正如,Olmstead,和,Palmer(1994),所预测，植物线粒体基因组因具有已知任何主要真核基因组中最低的同义置换率，已被发展用于研究陆生植物早期分化问题。,现用于这一研究领域及比较系统发育分析的线粒体基因主要有：,19S rDNA,、,cox,3,、,nad,5,和,mat,R,基因,。,34,三、植物系统学常用的,DNA,分析技术,DNA/DNA,杂交,RFLP,分析,DNA,的限制酶谱分析,核苷酸序列分析,PCR,技术,DNA,指纹技术,RAPD,分析,35,DNA,DNA,杂交,(DNA,DNA hybridization),是指在退火条件下，不同来源的互补,DNA,单链互相配对形成,DNA,双链的过程。,DNA,杂交按其作用的环境可分为液体内分子杂交,(,液相杂交,),和固体表面上进行杂交,(,固相杂交,),两种基本类型。液相杂交有羟磷灰石法、核酸酶,S1,分析及复性动力学分析法。,在植物系统学中多用复性动力学分析法，其基本原理是将不同来源的,DNA,溶液加热使之变性，形成单链,DNA,，然后冷却复性，若异源,DNA,之间具有相同序列区域，则复性时就会形成杂交,DNA,分子。因为,DNA,分子的热稳定性是两条子链碱基顺序互补性的函数，两条子链的配对程度越高，其热稳定性越强，反之，热稳定性就弱。与同源,DNA,分子相比，杂交,DNA,分子的热稳定性较弱，其熔解温度,(Tm,值,),低于同源,DNA,分子。这样，,通过测定同源,DNA,分子和杂交,DNA,分子的熔解温度，就可推测所比较的分类群,DNA,之间相同序列区域所占比例，进而判断出它们亲缘关系的远近。,DNA/DNA,杂交,36,例,1.Bendich,等,(1987),研究了黑麦属,(,Secale,),、小麦属,(,Triticum,),和大麦属,(,Hordeum,),的,DNA,重复顺序部分，揭示出黑麦属与小麦属亲缘关系较近而与大麦属亲缘关系较远。,例,2.Goldberg,等,(1993),研究了南瓜属,(,Cucurbita,)13,个物种间的系统演化关系。,例,3.Belford,等,(1995),则对滨藜属,(,Atripiex,)8,种植物的,DNA,单一拷贝顺序进行了研究，不仅为该属属下分类提供了有力的证据，而且对该属主要种的分化形成时期进行了判断。,例,4.Hilu,等,(1997),研究了禾本科叶绿体,DNA,，探讨了禾本科植物的系统演化关系。,由此可见,DNA,液相杂交技术在植物系统学研究中可用于科、属、种的系统发育研究以及种的分化形成时期的推测等方面。,但是这种方法实验繁琐，获得的杂交资料难于定性，很难排除误配、插入等因素的影响，而且对,DNA,样品的数量要求大，再加上放射性同位素标记的使用等大大限制了这种方法在植物系统学研究中的广泛应用。,DNA/DNA,杂交,37,DNA,固相杂交是根据互补碱基顺序配对的原理，将分子量较大的无放射性单链,DNA(,预先固定在膜上,),，与分子量较小的放射性标记的单链,DNA,，在最适杂交条件下，使其互补碱基之间形成氢键，从而把两条单链联结成为一种双链杂交分子。洗脱除去末配对的标记,DNA,片段。然后进行放射性测定，就可得到两种,DNA,链杂交百分比。,英国分子生物学家,Southern,所发明的,Southern,印迹法,(Southern blotting),是目前应用最为广泛的一种,DNA,膜杂交技术。这一方法是将,DNA,样品经限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，将胶浸泡在碱液中使,DNA,变性，然后将变性,DNA,转移到硝酸纤维素膜上，在,80,烘烤数小时，使,DNA,牢固地吸附在膜上。在较高的盐浓度及适当的温度,(,一般,68),下将其与经放射性同位素标记的变性,DNA,探针进行杂交，通过洗涤除去未杂交上的标记物，将纤维素膜烘干后进行放射自显影。这里所谓的,DNA,探针是指能识别特异核苷酸序列的带标记的一小段单链,DNA,分子。探针可以是,RNA,，也可以是,DNA,，其中,DNA,探针有的是克隆的,DNA,，也可是人工合成寡核甘酸，,rDNA,探针常用于系统学的研究。,Southern,印迹法的发明对分子生物学技术的发展起了巨大推动作用，它是目前进行,DNA,杂交普遍使用的方法，并且成为其它,DNA,分析技术的基础。,DNA/DNA,杂交,38,RFLP(Restriction fragment length polymorphism),分析即限制性内切酶酶切片段长度多态性分析，是目前植物系统与进化研究中使用较多的一种,DNA,分析技术，是指用限制性内切酶处理不同生物个体的,DNA,所产生的大分子片段的大小差异。,基本原理：,植物由于长期进化的结果，在种属间甚至品种间同源,DNA,序列上限制性内切酶识别位点不同，或者由于点突变、重组等原因，引起限制性内切酶识别位点上核苷酸的替换、插入或缺失变化从而引起,DNA,线性分子某一特定内切酶的识别位点发生变化。这样，植物,DNA,经适当的限制性内切酶切割成不同的限制性片段，由于不同大小的片段在凝胶上泳动速率不同，在凝胶上便形成了连续涂片，经,Southern,杂交、放射自显影后就能得到,DNA,的限制性片段多态性即,RFLP,。,由于,RFLP,起源于基因组,DNA,的变异、不受显隐性关系、环境条件和发育阶段的影响，具有稳定遗传和特异性的特点。在数量上不受限制，可随机选取足够数量能代表整个基因组的,RFLP,标记，而且每个标记变异大。检测方便，用于探测,RFLP,的克隆探针可随机选择。可以是核糖体,DNA,、叶绿体,DNA,，也可以是总,DNA,，这样就可以产生和获得能够反映种属遗传差异的大量多态性，为研究植物类群特别是属间、种间甚至品种间的亲缘关系、系统发育与演化提供有力的依据。,2.,RFLP,分析,39,例,1.Molnar,等,(1996),以小麦,rDNA,为探针研究了大麦属,25,个种的,rDNA,重复序列，揭示了它们之间的亲缘关系。,例,2.Cordesse,等,(1991),使用克隆水稻,rDNA,探针研究了稻属,(,Oryza,)47,个野生种和水稻,58,个栽培品系的,rDNA,间隔区的,RFLP,。,例,3.Steanl(1999),对桉属,(,Eucalyplus,)6,种的叶绿体,DNA,进行了,RFLP,分析。,目前，,RFLP,分析是植物系统学研究中使用较多的一种,DNA,分析技术。,RFLP,分析在实验方法上的一些改进，如尼龙膜代替了硝酸纤维素膜，使用有效的荧光标记或化学发光物质标记而不再使用放射性同位素标记等，也使得这一方法更易为植物系统学研究者接受和掌握。,2.,RFLP,分析,40,DNA,的限制酶图谱是表示,DNA,分子所有限制酶切点位置的简图，是进一步深入分析,DNA,的基础。植物种属间甚至品种间同源,DNA,序列上对不同限制性内切酶识别位点不同。,将纯化的,DNA(,往往用分子克隆法即从单一克隆扩增而制备,),，用不同的限制酶切割，进行凝胶电泳分析。对环形,DNA(,如叶绿体,DNA,和线粒体,DNA,等,),则要求先找出一个对该,DNA,只有一个切点的酶，以此点作为参考点，根据测量凝胶电泳图上各酶切片段的长度，决定各切点的位置，并用简图的形式表示出来。,叶绿体,DNA,因其相对较小，缺乏异质性，易于提纯，并且在进化上较为保守。所以对叶绿体,DNA,的限制酶图谱的确定和比较，常为研究较高的分类单位间,(,属间、科间、目间等,),的系统演化关系提供准确信息。,3.DNA,的限制酶图谱分析,41,3.DNA,的限制酶图谱分析,例,1.Kato,等用,7,种限制性内切酶构建了,azukibean,的限制性内切酶图谱，分析结果进一步确定了将其分类地位从菜豆属,(,Phaseduss,),划到豇豆属,(,Vigna,),，并发现它的杂草型类群在大单拷贝区有,96bp,的缺失，指出这是由重复序列分子内重组所致，这在遗传学上有较大意义。,例,2.Hilu,等,(1997),对一些禾本科植物的叶绿体,DNA,限制酶图谱进行了研究分析，结果表明雀麦属,(,Bromus,),在早熟禾亚科中处于孤立位置。他们进一步的研究发现在族级水平上，限制性片段图谱差异很大，在早熟禾族内黑麦草属,(,Lolium,),与羊茅属,(,Festuca,),叶绿体,DNA,同源值高达,75%,，显示了两属较近的亲缘关系，而在不同族的属间同源值仅为,2O,4O%,。,例,3.Janssn,等,(1995),以及,Warwick,等,(1997),分别对菊科和芸苔属,(,Brassica,),及其近缘属的叶绿体,DNA,限制性图谱进行了比较分析，为探讨它们的系统演化提供了可靠依据。,42,4.,核苷酸序列分析,核酸分子包含着生物遗传的信息，同时也记载着生物进化的历史，即核酸结构不仅指导生物的形态建成和个体发育，而且还能够反映生物之间的亲缘关系，目前生物分子系统的构建，都是基于这一原理而进行的。,DNA,核苷酸序列的测定，对于了解基因及其产物的结构、基因表达以及分子进化等具有重要意义，同时确定,DNA,核苷酸序列也是获得,DNA,分子间变异最为本质的信息。,DNA,测序方法有