乳鼠心肌细胞分离步骤.doc

一、细胞室灭菌
1. 将酒精灯、止血钳、枪、滴管架子、离心管架子、器械饭盒等清点无误后置于超净台内，紫外照射20-30min。
2. （注：物品不可重叠放置，否则会遮挡射线。培养细胞和培养用液不可照射紫外。）
3. 将实验服等摊开置于培养室，打开紫外照射20-30min。
4. 紫外照射结束后，打开超净台风机，吹10min，吹走O3。
5. （注：若超净台内物品不全，向台内拿取物品前，应先用75%酒精喷洒消毒。）

二、胶原酶1的配置
分离心肌细胞的胶原酶1浓度为：10mg胶原酶/12ml PBS。
具体方法为：（以下过程均在超净台内操作）
1. 称取10mg胶原酶于小烧杯中。
2. 加入12ml PBS溶液。
3. 灼烧止血钳，夹出青霉素小瓶，灼烧备用。
4. 用10ml一次性无菌注射器吸取小烧杯中溶液，用一次性无菌滤器过滤于青霉素小瓶中，即得到无菌的胶原酶1溶液，呈淡土黄色。

三、取材并分离心肌细胞
1. 用止血钳取5-6个平皿，分别加入适量PBS溶液。
2. 用止血钳夹住小烧杯壁，从器械饭盒中取出剪刀、镊子等器械。
3. 准备2个小烧杯，加入75%酒精适量，一个置于超净台外，一个置于超净台内。
先将乳鼠头朝下置于外面的小烧杯中消毒2min左右，取出，拿进超净台内，置于内部的小烧杯中消毒2min.
4. 左手捏住乳鼠背部皮肤，暴露出胸腔，右手拿一直的小剪刀，在中间靠左处剪开皮肤，左手轻轻一捏，其心脏即弹出来。
5. 剪下心室部分置于含PBS的平皿中。
6. 待8只乳鼠心脏全部取定后，换手套，喷酒精。
7. 左手拿镊子，右手拿剪刀，在心脏中间部位剪一刀，成“肉夹馍”形，在PBS中冲洗干净，洗去血细胞。
8. 将心室转移到另一新的培养皿中，继续清洗，此时可继续打开心室，取出余血。
9. 继续冲洗2-3遍，
10. 将洗好的心脏置于含转子的带盖玻璃瓶中（提前将转子取出置于干净处），加入2ml PBS溶液。
11. 灼烧剪刀，左手拿玻璃瓶，右手拿剪刀剪碎心脏成不能再剪的碎片。
12. 用枪吸掉上清，只留碎片，将转子放入玻璃瓶中，盖好盖子备用。
13. 取出4个10ml 玻璃离心管，各加入4ml含血清及BRDU的DMEM于其中。
14. 在含心脏碎片的玻璃瓶中加入2ml胶原酶1溶液。
15. 从超净台中取出玻璃瓶，置于磁力搅拌器上的小圆饭盒中（内含37°C热水），37°C消化5min。
16. 取出，喷酒精，拿回超净台内，吸取上清中已消化好的细胞加入到含血清和BRDU的DMEM的玻璃离心管中，此时加入到离心管中的上清中的胶原酶被稀释而减弱消化反应。
17. 在剩下的细胞碎片中再加入2ml胶原酶溶液，重复消化2次，每次消化结束后，均需将上清吸到上述离心管中。
18. 第4次消化改为37°C消化7min，将上清转移到离心管中反复重复消化（共4次37°C，7min）至不能消化为止。
19. 取含细胞消化液的玻璃离心管，用枪吹打混匀，使酶与DMEM充分混匀，并进一步分离组织块。
20. 配平后，从超净台中取出，1000转离心5min。
21. 离心结束后，取出离心管，拿回超净台内。
22. 取滴管1支，火焰灼烧整个滴管，置于滴管架上放凉备用。
23. 用滴管吸掉离心管中上清培养液以除去胶原酶，若吸不干净，管底允许留少许培养液。
24. 用枪加4ml新鲜的含血清和BRDU的DMEM于离心管中。
25. 取一只新的滴管，灼烧冷却后，吹打离心管中细胞，至细胞均匀悬浮。为控制吹打后量，吹打次数可固定，如100下。吹打时，滴管头部置于溶液底部，防治吹打出气泡。
26. 将200目筛网置于灭过菌的烧杯上，用滴管吸取细胞悬液，加到筛网上过滤，以除去未消化的组织块，只让单个细胞过滤到烧杯中。
此时，得到的细胞即为分离好的乳鼠原代心肌细胞及成纤维细胞。

四、分离的心肌细胞的培养
1. 将烧杯中的细胞溶液吸到培养瓶中/6孔板/96孔板中，做好标记。
2. 若用培养瓶培养，则先将瓶塞拧松半圈，置于孵箱中静置1-2h。
3. 因为成纤维细胞先贴壁，1-2h后，取出孵箱中的培养瓶于超净台中，竖起培养瓶，用滴管吸取细胞溶液于细口瓶。
4. 吹打均匀后，用细胞计数板计数。
5. 计数技术后，向6孔板中种细胞。用枪从细口瓶中吸取细胞溶液，加入到6孔板中，摇匀后，补充新鲜的含血清和BRDU的DMEM至2ml左右，标记后置孵箱中培养。
注：四1、2步骤后可显微镜观察培养瓶中的细胞。

五、清理实验用品和台面，并用酒精棉球擦洗超净台台面。

备注：接种细胞密度依实验目的而定
一般而言，进行细胞实验时，应结扎5×105密度/孔
提取蛋白实验时，应接种5×106密度/孔。