形态学检验技术.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2019/11/27,#,第一章 形态学检验技术,生物检验技术最主要的是掌握分析方法的一般要求，,而在进行分析或者检验之前,，一切必须从生物样品的采集开始，还包括样品的预处理和制备。,随后的检验和分析,可以千差万别，例如确定病原生物的种类、药物作用的时空变化、遗传基因的改变、食品毒物的含量等，这包括微生物检验、生物化学检验和分子生物学检验。,但在这些检验方法使用之前，,必须进行一系列的形态学检测。形态学检验需要逐步的在不同层次上展开进行，即感官层次、显微结构层次和超显微结构层次。,第一章 形态学检验技术,第一节 生物样品的采集、预处理和制备,第二节 感官层次的形态检验,第三节 显微形态检验技术,第四节 超显微形态检验技术,第一节 生物样品的采集、预处理和制备,1.1,样品采集的一般要求,1.2,采样的最一般方法,1.3,样品的制备,1.4,生物样品的预处理,1.1,样品采集的一般要求,采集的生物样品要具有,代表性,典型性,适时性,代表性,指采集的对象能够代表一定范围内的整体或者所有的样品。这就要求对样品的分布、类型、特征、地形地貌、环境、气候等因素进行综合考虑，选择合适的地段作为采样区，再在采样区内划分若干小区，采用适宜的方法布点，确定有代表性的个体或样品。例如在田地里采样，不要采集田埂、地边及距田埂地边,2,米以内的植株。,典型性,指所采集的生物个体的部位要能充分反映通过检验所要了解的情况。根据要求选取健康的生物个体，分别采集个体的不同部位，例如动物的血液、尿液、内脏、骨髓、肿瘤等，不能将各部位样品随意混合。,适时性,指需要充分注意生物的,不同生长发育阶段,。发育阶段的改变，也影响着样品的性质和生理。有些生物的有效成分在一昼夜间也常有变化，其他如生长地点、光照、土壤、其他环境条件等，对生物样品的特性均有一定影响。,同时还要注意样品采取后应该,及时处理的时间,。例如生物用药后的间隔时间；植物叶类应规定采嫩叶或老叶，采收的时间及层次，即生长在植株的不同位置，如上层、中层、下层；花类应严格规定采收时期及部分，如蕾期、开花前期或盛花期，采收全花、花被、柱头或其他部分等。,植物标本的采集注意事项,(1),采集的植物全株样品最好带有繁殖器官,(,花、果或孢子囊、子实体等,),，草本植物特别应该注意带有叶的部分和地下部分，寄生植物应带寄主。,(2),如果植物的基部叶与上部叶形状不同（如菊科、十字花科），叶上的附属物（毛茸、蜡被等）在新老叶上也有不同，应尽量采全。,(3),丛生的草本植物，应保留其丛生的特征，不要分得太散，失去原来的习性,(4),雌雄异株的植物（麻黄科、桑科等）应注意同时采集雌株和雄株。,(5),对于含水分较多（如景天科、仙人掌科等）或有根状 地下茎植物（如百合科），有时需切开干燥或用开水将其烫死。,(6),水生藻类植物采的标本，到驻地后要重新放在水里，然后用硬台纸将其托起，压成标本。,(7),木本植物的树皮在鉴别上有重要的特征，采集标本时应割取，并与标本同存。,(8),每种植物至少采集,3,份以上标本，每张标本应有野外记录。对易改变的特征如花的颜色、气味、毛茸等应说明。每晚必须及时整理检查，补上漏记的项目。,动物样品的采集,动物的尿液、血液、粪便、毛发、指甲、唾液、胃液、乳液、骨骼和组织等均可作为检验样品。,(1),尿液：绝大部分毒物及其代谢产物主要由肾脏经膀胱、尿道随尿液排出。,(2),血液：血液中有害物质的浓度可反映近期接触污染物质的水平，并与其吸收量呈正相关。,(3),毛发和指甲：蓄积在毛发和指甲中的污染物质残留时间较长，即使已脱离接触污染物或停止摄入污染食物，血液和尿液中污染物含量已下降，而毛发或指甲中仍容易检出。头发中的汞、砷等含量较高，样品容易采集和保存，故在医学和环境分析中应用较广泛。,(4),组织和脏器：组织和脏器的部位复杂，且柔软、易破裂混合，因此取样操作要细心。采集组织和脏器样品后，应放在组织捣碎机中捣碎、混匀，制成浆状鲜样备用。,1.2,采样的最一般方法,采样前应预先准备好采样工具，如刀具、剪刀、保存袋、手套、冰盒、标签、记录本、采集登记表等；,根据实际情况确定样品采样量：为了确保有足够数量的样品进行检测分析，应根据检测分析项目的内容要求确定样品的采集量。一般要求样品经制备后，至少有,20,50g,的干样品，最好备有,1kg,的干样；,整体样品需要在采样区内按梅花形五点或交叉间隔的取样方式采集,5-10,处的样品混合组成一个代表样品；,生物体上的某一部分作为样品，如果分布在一个部位，可以取此部分的全部作为样品；如果分布在多处，则每处取少量样品再加以混合。,将采好的样品装入保存袋中，可能还要放入冰盒中存放，贴好标签，并填写采样登记表。,平均样的获得：四分法、切成块的,1/4-1/8,混合。,梅花形五点,交叉间隔,1.3,样品的制备,(1),植物鲜样的制备,洗涤：将样品用清水、去离子水洗净，晾干或拭干；,切碎：将晾干的鲜样切碎、混匀，称取一定量于电动高速组织捣碎机的捣碎杯中，加适量蒸馏水或去离子水，开动捣碎机捣碎,1-2min,，制成匀浆。对含水量大的样品，如熟透的西红柿等，捣碎时可以不加水。,研磨：对于含纤维多或较硬的样品，如禾木科植物的根、茎杆、叶子等，可用不锈钢刀或剪刀切（剪）成小片或小块，混匀后在研钵中加石英砂研磨。,(2),植物干样的制备,风干：将洗净的植物鲜样尽快放在干燥通风处风干（茎杆样品可以劈开）。如果遇到阴雨天或潮湿气候，可放在,40-60,鼓风干燥箱中烘干，以免发霉腐烂，并减少化学和生物变化。,磨碎：将风干或烘干的样品去除灰尘、杂物，用剪刀剪碎（或先剪碎再烘干），再用磨碎机磨碎。谷类作物的种子样品如稻谷等，应先脱壳再粉碎。,过筛：将粉碎好的样品过筛。一般要求通过,1mm,筛孔即可，有的分析项目要求通过,0.25mm,的筛孔。制备好的样品贮存于磨口玻璃广口瓶或聚乙烯广口瓶中备用。,保存：对于测定某些金属含量的样品，应注意避免受金属器械和筛子等污染。因此，最好用玛瑙研钵磨碎，尼龙筛过筛，聚乙烯瓶保存。,1.4,生物样品的预处理,(1),消化分解：使用强酸或强碱等消化分解液，初步处理样品，使大部分蛋白等大分子物质在一定程度上降解或去除。,(2),提取、分离和浓缩,提取方法：一般将切碎的生物样品置于容器中，加入适当的提取溶剂，振荡、搅拌或磨碎，浸取一定时间，滤出溶剂，再用新提取溶剂洗涤样品滤残或再浸取一次，合并浸取液，供分析或进行分离、富集用。主要有振荡浸取法、组织捣碎提取法、脂肪提取器提取法、匀浆法等。,分离方法：将目的组分从粗提液中分离出来有多种方法，主要有萃取法、蒸馏法、层析法、低温冷冻法等。,低温冷冻法：该方法基于不同物质在同一溶剂中的溶解度随温度不同而不同的原理进行彼此分离的。,浓缩方法：生物样品的提取液经过分离净化后，待测物质浓度可能仍达不到分析方法的要求，这就需要进行浓缩。常用的浓缩方法有：蒸馏或减压蒸馏法、,K-D,浓缩器浓缩法、蒸发法等。,第二节 感官层次的形态检验,2.1,感官法,2.2,纸片法,2.3,试管法,2.1,感官法,“看”是感官法最重要的手段。“看”就是细致的观察样品，包括样品的全貌和样品各部位的特点，如形状、颜色、光泽、分泌物、毛、孔、表面和断面、斑点、刺等。如色黄的植物样品多含有黄酮类等。,“摸”就是用手触摸、揉捻、撕扯、折切等，感觉样品的粗糙程度、坚硬程度、断面特性等。如冬青科和卫矛科叶柄拉断有胶质丝。如将果实和种子放在滤纸上，用力压碎，稍干后看纸上有无油迹并估计含油的多少；检查鞣质类化合物，可用一把无锈的铁刀切开样品，如含鞣质，小刀及材料断面很快会变成兰黑色。,“嗅”就是用鼻子闻样品挥发出的气味，如把一些样品揉碎后，嗅其有无芳香气味。,“尝”就是用嘴舌来品尝，根据感觉来判断样品。如植物材料中，味苦的多含生物碱、甙类；味涩的多含鞣质，味酸的含有机酸。,2.2,纸片法,取样品抽提液滴在滤纸上，待展开，干后喷洒试液，可以检查多种成分。,生物碱：喷碘化铋钾试液，若斑点颜色显著加深，为阳性反应。,酚：醇浸液，喷三氯化铁试液，若斑点显兰绿（黑）色，为阳性反应。,有机酸：取水浸液，喷洒溴酚兰后，背景兰色，斑点浅黄色，为阳性反应。,黄酮类：醇浸液，喷三氯化铭醇试液，黄色及荧光均加深，为阳性反应。,蒽醌类：醇浸液，喷氢氧化钾试液，斑点显红色或暗红色，为阳性反应。,强心甙：醇浸液，加,Kedde,试液，斑点显紫色或浅紫色，为阳性反应。,内酯及香豆精类：醇浸液，加,3,Na,2,CO,3,，烤,15,分钟，滴加安替匹林及铁氰化钾，显紫红色，为阳性反应。检查山道年（,Santonin,）可将原料直接加甲醇钠，显紫红色为阳性反应。,还原物质：水及醇浸液，分别喷高锰酸钾试液，背景紫红色，斑点色浅或退色，为阳性反应。,2.3,试管法,类似纸片法,皂甙：水浸液置试管中，用力振摇，有持久性泡沫，为阳性反应。,蛋白质：水浸液，加入,NaOH,、,CuSO,4,，显淡紫红色，为阳性反应。,甙类、糖类：样品加水用稀酸酸化，煮沸,15,分钟过滤，滤液浓缩后，滴在纸片上，喷邻苯二甲酸苯胺试液，烘烤，斑点显棕红色，为阳性反应。,第三节 显微形态检验技术,3.1,显微镜的基本构造,3.2,光学显微镜的成像原理,3.3,显微镜的性能,3.4,显微镜的使用操作及注意事项,3.5,显微镜的分类,3.5,微生物涂片、染色的检验技术,3.6,显微制片技术,3.1,显微镜的构造,机械装置包括：镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件。,光学系统包括：反光镜、聚光器、接物镜、接目镜等组成，光学系统使物体形成物体放大像。,普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜（,Huygens eyepiece,），如要进行研究用时，一般选用性能更好的目镜，如补偿目镜（,K,）、平场目镜（,P,）、广视场目镜（,WF,）。照相时选用照相目镜（,NFK,）。,物镜成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径（,numerical apeature,简写为,NA,），每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。,数值孔径又叫做镜口率，它是由物体与物镜间媒质的折射率,n,与物镜孔径角的一半,的正弦值的乘积，其大小由下式决定：,NA=n,sin,NA=n,sin,空气介质,油介质,盖 玻 片,物 镜,根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：,A,、干燥系物镜：以空气为介质，如常用的,40,以下的物镜，数值孔径均小于,1,。,B,、油浸系物镜：常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为,90-100,，数值孔值大于,1,。,根据物镜放大率的高低，可分为：,A,、低倍物镜：,1-6,，,NA,值,0.04-0.15,；,B,、中倍物镜：,6-25,，,NA,值,0.15-0.40,；,C,、高倍物镜：,25-63,，,NA,值,0.35-0.95,；,D,、油浸物镜：,90-100,，,NA,值,1.25-1.40,。,根据物镜像差校正的程度来分类可分为：,A,、消色差物镜：是最常用的物镜，外壳上标有“,Ach”,字样，该物镜可以除红光和青光形成的色差。镜检时通常与惠更斯目镜配合使用。,B,、复消色差物镜：物镜外壳上标有“,Apo”,字样，除能校正红、蓝、绿三色光的色差外，还能校正黄色光造成的相差，通常与补偿目镜配合使用。,C,、特种物镜：在上述物镜基础上，为达到某些特定观察效果而制造的物镜。如带校正环物镜，带视场光阑物镜，相差物镜，荧光物镜，无应变物镜，无罩物镜，长工作距离物镜等,D,、目前在研究中常用的物镜还有：半复消色差物镜（,FL,），平场物镜,(Plan),，平场复消色差物镜（,Plan Apo,）,超平场物镜（,Splan,，超平场复消色差物镜（,Splan Apo,）等。,3.2,光学显微镜的成像原理,3.3,显微镜的性能,分辨力也叫分辨本领或解像力，光学显微镜分辨力定义为在,25cm,明视距离处能分辨清楚尽可能靠近的两点的能力，辨认两点之间的距离愈小，则分辨本领愈高，人眼的分辨力约为,100m,，而显微镜的分辨力,R,以下列公式计算：,R=0.61/NA,目前,NA,最大可以达到,1.4,；照明波长最短为,400nm,；代入公式可得,公式计算：,R=0.610.4/1.4=0.17,最大分辨率约,0.2,微米，约等于可见光最短波长的一半。,3.4,显微镜的使用操作及注意事项,(1),观察前的准备,(2),低倍镜观察,(3),高倍镜观察,(4),油镜观察,3.5,微生物涂片、染色的检验技术,细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。,常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。,当细菌分解糖类产酸使培养基,pH,下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。,染色前必须固定细菌。其目的有二：,一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；,二是增加其对染料的亲和力。,常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。,操作步骤：,涂片,干燥,固定,染色,水洗,干燥,镜检,3.6,显微制片技术,一般可分为非切片法与切片法两大类：,非切片法有涂片、铺片、压片、磨片、整装片等；,切片法又包括石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法等。,应用最广泛的,石蜡切片法制作过程是：取材固定冲洗脱水透明浸蜡包埋切片贴片烤片脱蜡复水染色脱水透明封藏。,(1),取材和固定,固定的目的在于保存组织内细胞原有的结构和形态，使其与生活时相似，因此要求固定的材料越新鲜越好。把动物杀死后应立即割取组织块，组织块的大小以厚度不超过,mm,为宜，并快速投入固定液中。固定时间为数小时至小时（需视组织块的大小而定）。,(2),冲洗,经固定的材料，可根据不同的固定液，分别用水或酒精冲洗，以洗去固定液，否则固定液留在组织会有碍染色。一些固定液固定的材料，可直接移入,70,酒精中，多换几次酒精，直至无黄色时为止。也可在酒精中加入几滴氨水或饱和碳酸锂溶液，以迅速洗去黄色。但留少许黄色也无妨碍。浸洗后的材料若暂时不制片，可保存于酒精中。,(3),脱水,柔软并含有多量水分的组织不易切成薄片，故必须增加组织的硬度。石蜡切片法就是使石蜡渗入组织，以达到支持增硬的作用。但水与石蜡是不相混合的，因此，在浸蜡、包埋前须将组织中的水分完全除去，这一步骤即为脱水。,常用的脱水剂是酒精。脱水时，先从低浓度的酒精开始，然后，递增浓度，直至无水酒精。具体方法是，将材料经,70,酒精,80,酒精,95,酒精第一次,95,酒精第二次无水酒精第一次无水酒精第二次，各级酒精,1-2,小时。脱水应彻底，否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。,(4),透明,酒精与石蜡不能混和，因此，脱水后的材料在浸蜡前，还必须经过透明。透明剂既可替代组织中的酒精，又能溶解石蜡，以利石蜡的渗入。二甲苯是常用的一种透明剂。,将脱水后的材料经,1,：,1,无水酒精与二甲苯二甲苯第一次二甲苯第二次，各级时间为,0.5-2,小时，务使组织达到透明为止。,(5),浸蜡,将已透明的材料移入熔化的石蜡内浸渍即为浸蜡。其目的是去除组织中的透明剂，而使石蜡渗入整个组织，获得一定的硬度和韧度，以便切成薄的切片。,先将装有,56-58,石蜡的三个蜡杯放在熔蜡箱内熔化，并使熔蜡箱的温度保持恒定（约,58,），切勿太高或太低。然后将透明了的材料放入蜡杯第一次蜡杯第二次蜡杯第三次。浸蜡时间视材料大小而定，一般总的浸蜡时间为,2-4,小时左右。,(6),包埋,将浸蜡后的材料包埋于石蜡中，并使它凝固成蜡块，这一过程称为包埋。,包埋前，视组织块的大小先将绘图纸折成一纸盒，作为包埋的容器。,将纸盒盛满已熔化的石蜡，随即将第三杯中已浸蜡的材料放入其中，应注意切面朝下，位置放正。然后速将纸盒半浸于冷水中，待石蜡表面凝结后，将纸盒全部浸入水中冷却。石蜡全部凝固后，拆去纸盒即成蜡块。,(7),切片,切片前，先将蜡块用刀片修整成上下两边平行的正方形或长方形，否则切出的蜡带弯曲不直，或无法连成带状。,将修整后的蜡块粘在小木块上，小木块装在切片机上，以待切片。,在旋转式切片机上将蜡块切成,4-8,m,厚的薄片。薄片最好是连续的蜡带。用毛笔轻轻取下蜡带，放在蜡带盒内备用。,(8),贴片与烤片,将蜡片粘贴在载玻片上即为贴片。,用小玻棒蘸取一点蛋白甘油滴于一干净的载玻片上，用手指涂匀，并加几滴蒸馏水于载玻片上。将蜡带按要求切成适当长度的蜡片，然后用小镊子将蜡片轻放在载玻片的水面上，再把载玻片放在展片台上（温度为,45,左右）。蜡片受热后即慢慢展平。待完全展平后，用解剖针将切片位置拨正，倾去载玻片上的余水后，将其放在烤片盒中，置于,50,左右恒温箱内烤干。,(9),染色,染色剂多为水溶液，故染色前必须先经脱蜡、复水等步骤。,以,H.E.,（苏木精一伊红）染色法为例,(10),脱水,切片依次入,95,酒精,()95,酒精,(),无水酒精,(),无水酒精,(),，各级中停留,1-5min,。,(11),透明,切片入,1,：,1,无水酒精、二甲苯二甲苯,(),二甲苯,(),，各级停留,1-5min,。,H.E.,（苏木精一伊红）染色法步骤：,A,、脱蜡：烤干的切片放入二甲苯二甲苯中，各为,5min,，以溶去切片上的石蜡。,B,、复水：是将脱蜡后的切片经各级浓度酒精逐渐下降到水的过程，即将二甲苯中取出的切片移入无水酒精,95,酒精,80,酒精,70,酒精蒸馏水，各级中停留,1-5min,。,C,、染色,将蒸馏水洗涤后的切片移入,Harris,苏木精液中,5-10min,，使细胞核着色。,用自来水洗去切片上残余的染液。,用盐酸酒精分色数分钟。分色时就是褪去细胞质不应着色部分的颜色，而使细胞核着色得清晰适度。分色时需随时用显微镜检查切片，使分色适度。,入氨水或自来水浸洗，使之蓝化。,在蒸馏水中浸片刻。,切片入,70,酒精,80,酒精,90,酒精各,1-2min,。,入,0.5,伊红酒精溶液中染色,2-5min,，使细胞质着色。,(12),封藏,将切片从二甲苯,(),中取出，用纸或布擦去材料周围的二甲苯。在材料中央滴一小滴树胶，然后，用镊子加盖盖玻片。,切片封好后，放在切片托盘上待干燥，即可用于观察。,染色结果：细胞核呈现鲜艳的蓝色，细胞质及细胞间质呈粉红至红色。,第四节 超显微形态检验技术,透射电子显微镜的发明者,E.Ruska,（,1932,）和扫描隧道显微镜的发明者,G.Binnig,和,H.Rohrer,（,1982,）共同获得,1986,年度诺贝尔物理学奖。,分辨能力从开始的几十纳米（,nm,）提高到,0.10.2,纳米，不同功能的电子显微镜也逐步出现，应用较多的有,透射电镜,、,扫描电镜,、,分析电镜,（具有,X,射线微区元素分析功能），具有较大发展潜力的扫描隧道显微镜等。,4.1,透射电子显微镜,4.2,扫描电子显微镜,透射电子显微镜结构包括两大部分：,主体部分为照明系统、成像系统和观察照相室；,辅助部分为真空系统和电气系统。,4.1,透射电子显微镜（,Transmission Electron Microscope,，,TEM,）,照明系统,该系统分成两部分：电子枪和会聚镜。电子枪由灯丝,(,阴极,),、栅极和阳极组成。加热灯丝发射电子束。在阳极加电压，电子加速。阳极与阴极间的电位差为总的加速电压。经加速而具有能量的电子从阳极板的孔中射出。射出的电子束能量与加速电压有关，栅极起控制电子束形状的作用。电子束有一定的发散角，经会聚镜调节后，可望得到发散角，很小甚至为,0,的平行电子束。电子束的电流密度,(,束流,),可通过调节会聚镜的电流来调节。,成像系统,该系统包括样品室、物镜、中间镜、反差光栏、衍射光栏、投射镜以及其它电子光学部件。样品室有一套机构，保证样品经常更换时不破坏主体的真空。样品可在,X,、,Y,二方向移动，以便找到所要观察的位置。经过会聚镜得到的平行电子束照射到样品上，穿过样品后就带有反映样品特征的信息，经物镜和反差光栏作用形成一次电子图像，再经中间镜和投射镜放大一次后，在荧光屏上得到最后的电子图像。,观察照相室,电子图像反映在荧光屏上。荧光发光和电子束流成正比。把荧光屏换成电子干板，即可照相。干板的感光能力与其波长有关。,真空系统,真空系统由机械泵、油扩散泵、离子泵、真空测量仪表及真空管道组成。它的作用是排除镜筒内气体，使镜筒真空度至少要在,10,-5,托以上，目前最好的真空度可以达到,10,-9,至,10,-10,托。如果真空度低的话，电子与气体分子之间的碰撞引起散射而影响衬度，还会使电子栅极与阳极间高压电离导致极间放电，残余的气体还会腐蚀灯丝，污染样品。,供电控制系统,加速电压和透镜磁电流不稳定将会产生严重的色差及降低电镜的分辨本领，所以加速电压和透镜电流的稳定度是衡量电镜性能好坏的一个重要标准。透射电镜的电路主要由以下部分组成，高压直流电源、透镜励磁电源、偏转器线圈电源、电子枪灯丝加热电源，以及真空系统控制电路、真空泵电源、照相驱动装置及自动曝光电路等。,另外，许多高性能的电镜上还装备有扫描附件、能谱议、电子能量损失谱等仪器。,投射电镜制样技术,扫描电镜主要用二次电子观察形貌。在扫描电镜中，电子枪发射出来的电子束，经三个电磁透镜聚焦后，成直径为几个纳米的电子束。末级透镜上部的扫描线圈能使电子束在试样表面上做光栅状扫描。试样在电子束作用下，激发出各种信号，信号的强度取决于试样表面的形貌、受激区域的成分和晶体取向。,4.2,扫描电子显微镜（,Scanning Electron Microscope,，,SEM,）,扫描电子显微镜示意图,设在试样附近的探测器把激发出的电子信号接受下来，经信号处理放大系统后，输送到显象管栅极以调制显象管的亮度。由于显象管中的电子束和镜筒中的电子束是同步扫描的，显象管上各点的亮度是由试样上各点激发出的电子信号强度来调制的，即由试样表面上任一点所收集来的信号强度与显像管屏上相应点亮度之间是一一对应的。因此，试样各点状态不同，显象管各点相应的亮度也必不同，由此得到的图像一定是试样状态的反映。放置在试样斜上方的波谱仪和能谱仪是用来收集,X,射线，借以实现,X,射线微区成分分析的。值得强调的是，入射电子束在试样表面上是逐点扫描的，象是逐点记录的，因此试样各点所激发出来的各种信号都可选录出来，并可同时在相邻的几个显象管上显示出来，这给试样综合分析带来极大的方便。,SEM,的主要特点,A,、放大倍率高：可从几十倍放大到几十万倍，连续可调。观察样品极为方便。,B,、分辨率高：目前用,W,灯丝的,SEM,，分辨率已达到,3nm-6nm,场发射源,SEM,分辨率可达到,1nm,。,C,、景深大：景深大的图像立体感强，对粗糙不平的断口试样观察需要大景深。一般情况下，,SEM,景深比,TEM,大,10,倍，比光学显微镜（,OM,）大,100,倍。,D,、保真度好：试样通常不需要作任何处理即可以直接进行形貌观察，所以不会由于制样原因而产生假象。这对断口的失效分析及贵重试样的分析特别重要。,E,、试样制备简单：试样可以是自然面、断口、块状、粉体、反光及透光光片，对不导电的试样只需蒸镀一层,10nm,左右的导电膜。,另外，现在许多,SEM,具有图像处理和图像分析功能。有的,SEM,加入附件后，能进行加热、冷却、拉伸及弯曲等动态过程的观察。,扫描隧道显微镜示意图,（,Scanning Tunneling Microscope,，,STM,）,STM,是利用直径为原子尺度的尖锐探针扫描样品表面，并测定流过探针的隧道电流得到超高分辨的三维图像。,成像过程中探针与样品表面之间的距离小于,1nm,，电子云互相重叠，在这两物体间施加,2mv2v,的电压，电子就可因量子隧道效应有针尖（或样品）转移到样品（或针尖），从而在针尖和样品间形成隧道电流。,STM,横向分辨率为,0.10.2nm,，深度分辨能力为,0.001nm,，放大倍数可以达到数千万倍。,克服了电子显微镜中高能电子束对样品的辐射损伤以及样品必须处于高真空中的限制。,STM,可以在超高真空、高真空，也可以在大气下甚至液体中无损伤的直接观察样品表面结构。,