微生物发酵法生产透明质酸的研究.doc

燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书
燕山大学
课 程 设 计 说 明 书

微生物发酵法生产透明质酸的研究

学院（系）： 环境与化学工程学院
年级 专业： 10生物化工
学 号： 100110050050
学生 姓名： 王伟伟
指导 教师： 张晓宇
教师 职称： 副教授

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燕山大学课程设计（论文）任务书
院（系）：环境与化学工学院 基层教学单位：生物工程系
学 号
100110050050
学生姓名
王伟伟
专业（班级）
10生物化工
设计题目
微生物发酵法生产透明质酸的研究
设
计
主
要
内
容
1. 摇瓶培养基组成对透明质酸发酵的影响
2. 培养条件对透明质酸发酵的影响
3. 结合各种因素综合分析，得出最优化的发酵工艺。
设
计
要
求
1.要有明确设计的目的
2.设计合理的操作方式
3.设计出合理的测定指标
4.设计的内容要与题目基本一致
5.设计总结与分析
工
作
量
1.至少阅读15篇以上的相关科技文献
2.设计文字至少在15000字以上
工
作
计
划
11.25——11.27 课程设计准备阶段
11.28——11.29 明确思路，确定任务
11.30 ——12.2 课程设计说明书编写阶段
12.3 ——12.4 设计答辩阶段
12.5——12.6 说明书完善过程
12.7——12.8 答辩
参
考
资
料
[1] 岩田修造. 日本眼科纪要, 1987, 38, 927
[2] 罗瑞明, 李亚蕾, 徐桂华, 等. 以兽疫链球菌 NUF-036 分批发酵生产透明质酸的工艺研究及其动力学模型的建立[J]. 宁夏大学学报(自然科学版), 2004, 25(4): 368-374
[3] Marco.L.F, Giuseppin, Natal.A.W.Metabolic Modeling of Saccharomyces cerevisiae Using the Optimal Control of Homeostasis A Cybernetic Model Definition[J]. Metabolic Engineering. 2000, 2(1): 14221
指导教师签字

基层教学单位主任签字

说明：学生、指导教师、基层教学单位各一份。
2013年12月2日

燕山大学课程设计成绩评定表
设计者姓名: 王伟伟 学号: 100110050050
设计题目: 微生物法生产透明质酸的研究

说明书评分：
设计思路： 20分
字数要求： 20分
文档排版： 20分
格式细节： 20分
分析讨论： 20分

成绩：

答辩小组评语：

口语表达：满分20分
幻灯质量：满分20分
设计分析：满分40分
回答问题：满分20分

成绩：

课程设计总成绩： （说明书成绩×0.5+答辩成绩×0.5）

答辩小组成员签字：
年 月 日

2013 秋季学期
生物工程专业课程设计
结题论文

微生物发酵法生产透明质酸的研究

学院（系）： 环境与化学工程
年级 专业： 10 生物化工
学 号： 100110050050
学生 姓名： 王伟伟
指导 教师： 张晓宇
教师 职称： 副教授

摘 要
为提高微生物发酵生产透明质酸的质量，本设计选用经过突变后的高产兽疫链球菌株做为发酵用的菌种，并且在发酵前经过了严格的灭菌操作。设计内容主要分为三部分：摇瓶培养基组成对透明质酸发酵的影响；培养条件对发酵结果的影响；通过发酵过程中各种参数的变化优化发酵条件。第一部分设计拟采用正交设计法确定最合适的种子培养基；第二部分设计拟单因素分析法确定外界最适发酵条件；第三部分通过测定发酵过程的各种参数绘制参数变化曲线，为发酵条件的优化提供科学依据。通过本次设计，制定出兽疫链球菌生产透明质酸的合适工艺流程。

关键词：透明质酸； 兽疫链球菌； 正交设计； 单因素分析

目录
第一部分 文献综述
1 透明质酸 1
1.1 概述 1
1.2 结构 1
1.3 HA理化性质 2
1.4 HA的合成和代谢 3
1.4.1 HA的合成 3
1.4.2 HA的代谢 4
1.5 HA的生理功能 5
1.5.1 构成多种基质 5
1.5.2 保水、润滑、渗透压调节及分子排阻效应 6
1.5.3 对细胞的作用 6
1.5.4 与蛋白质的结合及其作用 6
1.6 HA的应用 7
1.6.1 HA在化妆品领域的应用 7
1.6.2 HA在医学领域的应用 8
1.6.3 HA在食品领域的应用 8
2 HA的制备 9
2.1 从动物组织中提取 9
2.2 微生物发酵法 10
3 国内外发展概况及其市场发展前景 11
第二部分 课程设计
1.材料 14
1.1 试验用的仪器 14
1.2 试验药品 14
2. 方法 15
2.1 细菌发酵法生产透明质酸的工艺路线 15
2.2 兽疫链球菌发酵生产透明质酸的工艺流程 15
2.2.1 摇瓶种子液的培养 15
2.2.2 种子罐种子液的培养 15
2.2.3 发酵 16
2.2.4 下游分离纯化 16
2.3 检测方法 16
2.3.1 HA 含量的检测方法（Bitter-Muir 咔唑法） 16
2.3.2 还原糖的测定方法—DNS法 17
2.3.3 菌体含量的测定 17
3． 设计 18
3.1 摇瓶培养基组成对透明质酸发酵的影响 18
3.2 培养条件对透明质酸发酵的影响 20
3.2.1 摇床转速对摇瓶种子培养的影响 20
3.2.2 温度对摇瓶种子培养的影响 20
3.2.3 添加剂对摇瓶种子培养的影响 21
4． 分析与展望 21
5． 设计体会 22
参考文献 24

第一部分 文献综述
1 透明质酸
1.1 概述
透明质酸(HyaluronioAcid, 简称 HA) 是一种由 N-乙酰葡糖胺和 D-葡萄糖醛酸双糖单元交替连接而成的酸性粘多糖。1934 年 Meyer 等自牛眼玻璃体内提取分离得到一种大分子多糖命名为HyafuronicAcid. 根据全国科学技术名词审定委员会公布的《生物化学名词》将其译为“透明质酸”，而《中国药典》国家药品标准则将其称为“玻璃酸”。目前国内在多种领域中用透明质酸，而在与药品有关的领域则用玻璃酸。经过半个多世纪的研究，人们对透明质酸的结构、理化性质和生理功能已有了明确的认识，在药品、化妆品、保健品以及临床眼科、骨科、皮肤科等领域有较多的研究和应用。[1]例如，由于其具有良好的保湿功能，广泛用于化妆品及口服美容保健食品中；作为粘弹性保护剂用于眼科手术和关节腔内注射治疗类风湿性关节炎和骨性关节炎等关节疾病；作为媒介在滴眼液中广泛应用；交联的透明质酸在术后粘连的预防和软组织修复等应用中获得成功；透明质酸与其他药物反应形成的加合物对药物发挥控释作用，可达到定向和定时释放的目的。近几年对透明质酸生理功能的认识有了重大突破，已形成了有透明质酸合成缺陷人的生命不可能存活的认识，可见其对肌体的重要性。由于透明质酸具有如此独特的生理功能，决定了它在药品、化妆品等工业上具有广泛的应用价值。因此对透明质酸的研究开发及其产业化的形成具有重要的意义和非常广阔的市场前景。
1.2 结构
卡尔·迈耶实验室在 1950年代阐明了透明质酸的化学结构。透明质酸是一种高分子的聚合物。是由单位 D-葡萄糖醛酸及 N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖[2]。 D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由 β-1,3-配糖键相连，双糖单位之间由 β-1,4-配糖键相连。双糖单位可达 25000 之多。在体内透明质酸的分子量从5千到2千万道尔。
分子式：（C14H20NNaO11）n
结构式如图：

1.3 HA理化性质
HA 具有许多天然豁多糖共有的性质，外观为白色、无定型固体[3]，水溶液带负电，电泳时移向负极。在高浓度1% 时，分子间会因氢键形成物理交联，呈网状形式存在，有很高的黏弹性和渗透压[4]。其水溶液的比旋度为 -70°~ -80° 与阿利新蓝、亚甲基蓝反应呈蓝色。在酸、碱、高温、X射线、γ射线、紫外线、超声波、铁、铜等金属离子、抗坏血酸或半胱氨酸等还原剂、氧自由基、透明质酸酶等因素下可发生降解，导致其黏性下降。经注射进人皮肤和关节的HA 其半衰期一般不超过 24 h[5]。商品透明质酸钠(Sodium hyalurone, 简称SH) 为白色纤维状或粉末状固体，无臭无味，有强吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂。
HA 溶液呈现非牛顿流体流变性，即HA 溶液的粘度随剪切速率的增加而显著的降低[6]。HA 溶液的这种特性可以理解为分子间的摩擦在较高的切变速率下，HA 分子被拉长或变形，此时溶液粘度的大小不在完全取决与分子量的大小，同时也取决于HA 分子的大小即浓度，同一浓度的HA 水溶液，即使分子量不同，当切变速率达到某一特定值时，其粘度可降至相同。而对同一相同分子量的HA 溶液，在任何切变速率下，粘度总是与浓度呈正比关系。
1.4 HA的合成和代谢
1.4.1 HA的合成
很早就知道HA 是由尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡糖（UDP-GlcNAc）和尿苷二磷酸-葡糖醛酸（UDP-GlAc）合成而来[7]，但对其合成场所及合成过程不甚明了。直到20 世纪80 年代，对HA 的合成机理才有了明确的认识。Prehm的研究发现，细胞浆膜的膜内壁是合成HA 的场所，在HA 合成酶的作用下，HA多糖链的还原末端所连UDP 释出，多糖链交替连接上UDP-GlcNAc 和UDP-GlAc，生成的HA 链伸出细胞外，使其不受限制地延伸。HA 的合成与其他大分子多糖如硫酸软骨素、肝素等不同，后者的合成场所为细胞内的高尔基体，糖链的延伸发生在非还原端，合成后还需要进行硫酸化、差向异构化和脱乙酰化等改构[8]。
对一些原核细胞和真核细胞的HA 合成酶进行了结构和功能研究。目前已知成纤维细胞的HA 合成酶的组成和结构，也明确了不同亚基在HA合成中所起的作用。VandeRijn 等[9,10]发现，链球菌细胞膜内有三种蛋白质发挥与UDP-GlAc 结合作用。在真核细胞内，也发现了一系列具 HA合成活性的蛋白质。这些浆膜蛋白质在HA的合成过程中发挥合成及转动功能。O’Regan 等[11]对 HA 的合成机理和有关基因的研究进行了详述。
许多因素可调控 HA 的合成，通过调节 HA 合成酶分子中大、小亚基的磷酸化程度以调节HA 合成酶活性。当存在合成HA 的前体物质 UDP-GlcNAc 或 UDP-GlAc 时，合成酶大亚基内的酪氨酸则发生自动磷酸化，这是引发 HA合成的必经步骤。小亚基丝氨酸也可磷酸化，当丝氨酸磷酸化程度增高时，酶的活性即降低。激素、炎症因子、生长因子、细胞流行性物质、腺苷酸环化酶、肿瘤细胞等均可通过调整 HA 合成酶的活性来调节 HA 的合成。
1.4.2 HA的代谢
通过对合成 HA 的前体物质进行标记、对 HA 标记以及直接测定未标记HA 注入不同时间后在注入部位的残留量等手段，对HA 在体内的代谢进行了研究，包括对临床用药途径如注入眼前房内、关节腔内等的HA 的清除进行了考察。20世纪80 年代后，Dahl 等设计了新的方法，将HA 连接上[125I]-酪胺纤维二糖标记物，后者在 HA 代谢时随 HA 从细胞外转移至细胞内，在溶酶体发生降解时，可残留在代谢部位的细胞内长达数小时，据此可测定不同部位 HA 的代谢比率和清除率，弥补了以前的方法只能确定 HA 的代谢部位而不能准确测定其代谢量的不足。
在正常状况下，HA 在体内主要是通过酶降解而清除，但发生某些疾病时，体内产生的自由基也可对其产生降解作用，如发生RA 时，滑液中的氧自由基导致其中的 HA 发生降解。降解HA的酶主要为透明质酸酶（HAas）、β-D-葡糖苷酸酶和 β-N-乙酰-D-氨基已糖苷酶。HA 的代谢和清除主要发生在局部、淋巴系统和等组织，HA 首先与细胞受体结合，被摄入到细胞内，与溶酶体融合后，先经Haas降解，形成 HA 寡糖，再 β-D-葡糖苷酸酶和 β-N-乙酰-D-氨基已糖苷酶的进一步作用降解成单糖。生成的单糖转移至胞质内，进一步氧化分解成小分子物质排出体外，或作为前体物质重新用于合成 HA。
迄今为止，除脑组织以外，对HA 在各组织中的代谢情况已基本了解。研究发现，HA 除在其合成处部分发生代谢以外，大量的HA 转移至淋巴结和肝脏代谢。在皮肤、软骨、骨及细胞间质（ICM）等组织中，HA与组织内的其他成分结合密切，主要以结合状态存在，有些主要以新、老替代方式发生局部代谢。以皮肤为例，每天代谢量为局部所含HA 总量的20% 左右。体内呈游离状态的HA 如关节滑液、细胞间液、外周淋巴液、血液中的HA以及注入的外源性HA 则主要在淋巴结和肝脏代谢。淋巴结可从传达室入淋巴液中截留其所含HA 总量的 50%～90%, 在此发生部分降解。HA 在血液中的代谢速率很高，如对人和兔的研究结果表明，静脉注射进入血液的HA在血液中的半衰期很短，只有2.4～5 min, 清除比率常数为0.13～0.28 min-1, 相当于每1 min有25% HA 从血浆中清除掉。血浆中的HA 主要在肝脏发生代谢而清除，研究发现，静脉搏注标记的 HA 后，占注射总量 90% 的放射性物质被发现集中在肝脏。
HA 被淋巴结和肝脏摄取进而清除是由受体介导而生的，淋巴窦的内衬细胞和肝脏窦间隙内皮细胞是摄入HA的主要细胞。HA 的 Mr 是决定 HA 与细胞受体亲和力的主要因素，Mr 越高，与受体的亲和力越强[12]。
1.5 HA的生理功能
1.5.1 构成多种基质
HA 是构成细胞外基质和细胞间质的主要成分。结缔组织由大量的 ICM和少量细胞组成，结缔组织内基质的合成、分泌、结构及性质对其内的细胞代谢和功能具有重要的影响，ICM 填充在细胞间隙内，维持组织的结构完整，为细胞提供内环境，对到达细胞的物理及分子信息进行过滤和甄别，对细胞的生理功能产生影响，从而奠定了HA 通过 ICM 对结缔组织重量功能起主要作用的重要地位。
1.5.2 保水、润滑、渗透压调节及分子排阻效应
HA分子中含有的大量羧基可与水形成氢键而结合大量的水，以Mr为4×106 的HA为例，当浓度不足0.1% 时，HA 分子就占据了溶液的所有空间，即HA 或结合其重量1000倍的水。基质中的HA具有固定及阻止水流动的功能，若用Haas 将所含的 HA 降解破坏后，水的通透性会明显增加[13]。关节软骨表层拥有的HA大分子网状结构可防止软骨的负重时将大量的液体从软骨中挤出，保证软骨内的水分，从而保证了软骨的弹性及缓冲应力的作用[14,15]。HA 是皮肤保持水分和弹性的主要成分，随着年龄的增加，皮肤所含的 HA浓度和 Mr 明显降低，导致皮肤干燥和皱纹的产生。一些抗皱美容护肤品就是利用其中的HA 发挥局部的保水功能，或利用一些活性物质促进皮肤HA的代谢来发挥作用的。
1.5.3 对细胞的作用
目前已知 HA 对细胞具有多种作用，如保护细胞，影响细胞移动、增殖和分化，影响细胞的吞噬功能，屏蔽细胞膜上的机械感受器等，此外，HA还可以通过反馈作用调节 HA 合成细胞的合成能力。
1.5.4 与蛋白质的结合及其作用
体内存在多种可与HA 特异性结合的蛋白质，主要分布在细胞膜上，人们将这些蛋白质统称为HA 结合蛋白（HA-binding proteins, HABP）。在体内，这些蛋白质多与多糖结合形成复合物，Toole 等将上述的HABP 以及其它多糖组成的复合物统称为HA 粘附质（hyaladherin），分布在细胞膜、基质内还是体液。基质内和细胞膜上的HA 粘附质HA 进行基质装配、作用于细胞、产生一系列生理活性的先决条件，没有HA 粘附质的存在，HA 除粘弹性以外的其他生理功能则无处可言。
1.6 HA的应用
1.6.1 HA在化妆品领域的应用
上世纪80年代，HA 优异的保湿功能受到了化妆品界的广泛关注，许多国际上著名的化妆品生产商开始竞相开发生产含HA 系列的化妆品。目前，国内外化妆品市场上添加透明质酸的高档护肤品日益增多，已成为国际日化界的主流产品。含透明质酸的化妆品被形象的称为“仿生化妆品”，据报道，透明质酸可以添加于口红、膏霜、乳液、美容液、面膜、粉底、精华素等护肤品中，也可用于洗发、护法、洗面奶中。日本资生堂生产的“BH-24”精华素、美国Revlon公司的“MOONDROPS”保湿剂、法国 Maybellin 公司生产的 Hydrobella 润肤露等含 HA 化妆品，尽管价格十分昂贵，仍深受消费者的喜爱。
透明质酸是具有直链结构的高分子生物粘多糖，其水溶液具有高度的粘弹
性，与油乳化后形成的膏体细腻均匀且具有稳定的乳化作用。透明质酸的大分子功能可调节细胞膜表面及周围正离子的流动和变化，可以在改变化妆品中其他元素在皮肤中的扩散速率，参与水和电解质的输送；较低分子量的HA可以渗透表皮，扩张毛细血管、增加血液循环、改善中间代谢、促进皮肤的营养吸收，阻止细胞中一些氧化酶的产生，减少自由基的形成并防止自由基破坏细胞结构，从而增加细胞弹性。当使用含有HA 的化妆品时，HA 能迅速的在皮肤表层形成一层粘弹性的水化膜，该水化膜可以有效地保持皮肤水分不挥发，润湿角质层，维持和加强角质层自身的吸水能力和屏障功能，促进皮肤对化妆品中其他活性物质的吸收，防止皮肤干燥，增加皮肤的细嫩润滑和弹性，使皮肤柔软光滑，延缓和防止皮肤的过早衰老。HA 还能改善皮肤生理条件，阻止外来细菌、灰尘的侵入，加强营养物质的供给，为真皮胶原蛋白和弹性纤维的合成提供优越的外部环境。因此，透明质酸的这种保湿性和营养性的双重作用，是其他任何保湿剂无法比拟的。
不同化妆品特性和用途决定了透明质酸的分子量和添加量的不同。分子量越大，成膜性越好，但渗透性差；分子量小的产品，渗透作用好，但成膜性相对较差。因此，根据化妆品的不同需要选择不同分子量的透明质酸。化妆品中HA添加量一般在千分之二左右，特殊化妆品添加量可以达到千分之五，一般来说抗皱防晒类化妆品应选择高分子量的产品，添加量也相应的较高，洗面奶、面膜等化妆品主要利用透明质酸的通透性，分子量应选择低一些，添加量一在在千分之一左右。
1.6.2 HA在医学领域的应用
透明质酸是构成人体细胞间质、眼玻璃体、关节滑液等结缔组织的主要成分，在体内发挥保水、维持细胞外空间、调节渗透压、润滑、促进细胞修复等重要生理功能。透明质酸分子中含有大量的羧基和羟基，在水溶液中形成分子内和分子间的氢键，这使其具有强大的保水作用，可结合自身 1000 倍以上的水；在较高浓度时，由于其分子间作用形成的复杂的三级网状结构，其水溶液又具有显著的粘弹性。透明质酸作为细胞间基质的主要成分，直接参与细胞内外电解质交流的调控，发挥物理和分子信息的过滤器作用。大分子透明质酸对细胞移动、增殖、分化及吞噬功能有抑制作用；小分子透明质酸则有促进作用。透明质酸具有独特理化性质和生理功能，在医学方面已得到广泛应用。例如，透明质酸常被用作眼科人工晶体植入手术的粘弹剂、骨性关节炎和类风湿性关节炎等关节手术的填充剂，作为媒介在滴眼液中也得到了广泛应用。此外，HA 还用于预防术后粘连和促进皮肤伤口的愈合，与其它药物反应形成的化合物对药物发挥缓释作用，可达到定向和定时释放的目的。因此，随着医药科技的发展，透明质酸在医药方面的应用将越来越广泛。
1.6.3 HA在食品领域的应用
人体中的透明质酸的含量约为15 g，在人体的生理活动中发挥着重要作用。如果人体皮肤中的透明质酸含量减少，皮肤的保水功能就会大大的减弱，显得粗糙并产生皱纹；若其它组织和器官中的透明质酸减少，可能会导致关节炎、动脉硬化、脉搏紊乱和脑萎缩等病症；同时，人体中透明质酸的减少还会产生早老症。但是，通过口服透明质酸可以能够补充体内透明质酸含量的不足。口服透明质酸后通过消化、吸收，可使皮肤滋润光滑、柔软而富有弹性，可延缓衰老，防止关节炎、动脉硬化、脉搏紊乱和脑萎缩等病症的发生；可使人精力充足，富有青春活力。口服透明质酸已在欧美等发达国家中广泛应用于保健食品中。
2 HA的制备
透明质酸的制备方法主要有以动植物组织为原料的提取法和微生物发酵法。
2.1 从动物组织中提取
HA 在动物组织中的分布较为广泛，几乎所有的动物组织中均含有 HA，只是含量不同，能够用于生产的原料主要为鸡冠、人脐带和动物眼球。
提取法生产HA 的主要工艺过程包括提取、除杂、沉淀和分离。原料不同，HA 的提取有一定的差异。在提取的同时常用蛋白酶降解蛋白质部分，几乎可达到完全提取，所用的蛋白水解酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶等，不可用胃蛋白酶，因胃蛋白酶的最适pH 值太低，易导致HA 的酸水解。得到的酶解液中仍含有残存的蛋白质和小分子物质，可用等电点沉淀法、加热变性法、蛋白质沉淀剂法等去掉残存蛋白质。
去掉小分子物质最常用的方法是透析法和超滤法，而超滤法适合于大规模生产。采用先粗滤后精滤的方法，并加纸浆、硅藻土、活性白土或活性炭助滤。硅藻土、活性炭等吸附剂可除杂、脱色。
沉淀HA常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、乙酸、乙醚等。乙醇沉淀是分级分离HA的经典方法。而CPC (氯化十六烷基吡啶)络合沉淀也是分级分离 HA 常用的方法之一，纯化效率和回收率高，可以从很低浓度的溶液中将HA沉淀出来。除CPC 外，还可用嗅化十六烷基吡啶 (CPB)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等其他长链季按盐。某些阴离子交换剂也可用来纯化HA，如 Dowexl2X, DEAE2 纤维素。
2.2 微生物发酵法
日本主要利用发酵法生产 HA，利用现代发酵技术和发酵设备，使 HA 发酵产率水平从2~4 g/L提高到6 g/L。日本已有发酵生产的 HA 上市，价格大大低于从动物组织提取的产品。英国和美国也有少量发酵法报道。目前,国际先进的HA发酵产率为6~7 g/L。我国HA研究起步较晚，其发酵产率为4~5 g/L，从发酵液到最终产品的纯化收率为60%~70%。
利用微生物发酵法生产HA，关键在于菌种的选育、发酵条件的优化及HA 的纯化。
1937年，Kendall 等发现链球菌可产生 HA。研究结果表明，链球菌属的多种细菌具有荚膜，这种荚膜的主要成分就是 HA。发酵生产HA 所用的菌种一般是将产生HA 的链球菌进行物理诱变、化学诱变或物理化学诱变相结合处理得到的。物理和化学诱变相结合的方法多采用紫外照射外加NTG 反复处理，从而筛选出高产菌株。
发酵条件对链球菌产生HA 有很大影响。发酵液的 pH 通常控制6.5~7.5，不同的菌株对 pH 的要求有所不同。搅拌速率、搅拌方式及搅拌器类型对HA的产生及相对分子量都有影响，高搅拌速率能显著提高HA 的相对分子量，但过高速率反而会降低HA 的相对分子量，通常控制在100~800 r/min 之间。链球菌属兼性厌氧菌，发酵时通气并不明显影响菌体的生长，但通气能提高HA 的相对分子量，通气量控制在0.2~2 vvm，发酵温度通常为37 ℃。在发酵液中加人一些自由基清除剂，如香草酸、水杨酸、单宁酸等，可在一定程度上保护HA免受通气时产生自由基的影响，提高HA的相对分子量。碳源如葡萄糖选择分批加入，可使HA 产量提高10% 左右。发酵液中加人少量的溶菌酶也可提高HA 的产量，溶菌酶的作用被认为是破坏细菌细胞壁，使得细菌不得不分泌更多的HA 来保护自己。
从发酵液中提取 HA，通常加入杀菌剂或加热灭活菌体后，离心或过滤除菌杀灭和除去发酵液中的菌体。如HA 含量较高时，发酵液黏度很高，需要用水稀释后再离心或过滤除菌，滤液再经乙醇沉淀、CPC 沉淀、超滤等方法进行分离纯化，最后用有机溶剂沉淀、真空干燥得到最终产品。
3 国内外发展概况及其市场发展前景
目前我国建立了提取透明质酸的工厂。如在山东、广西有了从鸡冠中提取；北京的用猪皮提取透明质酸的工厂。但是这种方法由于原料有限，且透明质酸的含量低、材料分散(如新鲜脐带中透明质酸收率仅有 0.2%)，同时它还与蛋白质、硫酸软骨素等粘多糖共存于生物组织中，致使其收率低，提纯杂，成本过高，因而价格十分昂贵，限制了它的广泛应用。此外，生物体中的透明质酸酶使透明质酸分子量、粘度、保湿性等降低也是限制其普遍应用的因素之一。
从八十年代开始，各国科技工作者试图以发酵法生产透明质酸代替从生物体中提取，迄今该方面的研究、应用都取得了较大进展，先后从 StrePtococcus 细菌中选育出生产透明质酸的高产菌种，其产酸能力最高可达 7-8 L。在提制方面的研究也取得良好进展。日本资生堂在 80 年代中期实现了发酵法生产透明质酸的工业化，并成功地应用于其所生产的各种化妆品中。英国采用几个发酵罐串联发酵使透明质酸产量大增加。而且用发酵法生产透明质酸质量稳定，其原料为葡萄糖、淀粉等，原料易得不受限制，大大降低了生产成本，为其广泛推广应用奠定了基础。
九十年代，随着透明质酸应用范围的拓展，其需求量不断增加。1995 年国际市场透明质酸的总销售额达 6 亿美元，价格化妆品级达 5000 美元/公斤，医药级达 20 万美元/公斤。据 frost﹠sulhvan 的调查表明，1998 年美国市场透明质酸的销售额达 2.3 亿美元，预计到 2005 年将以年 14% 的速度增长。国际市场 1998 年的销售额超过了 10 亿美元。近年来，化妆品用透明质酸的价格已由 5000 美元/公斤降至 3000-4000 美元/公斤，但药用级透明酸价格变化不大。
在国内，中外合资山东福瑞达制药公司 90 年代初开始从器脏中提取透明质酸，售价达 10 万元/公斤，同时它也对透明质酸的应用以及发酵法生产透明质酸进行了较为系统的研究。另外北京化工大学、无锡轻工大学、郑州畜牧工业专科学校、四川省食品发酵工业研究设计院等一些国内科研机构也开展了这方面的研究，并取得较好的进展。目前我国在高标准(药用级)透明质酸的生产上仍是空白。因此，进一步加强我国发酵法生产透明质酸的研究并尽快实现产业化，具有非常重要的意义，也将取得巨大的经济效益。

第二部分 课程设计部分

微生物发酵法生产透明质酸的研究

透明质酸是应用在医药、化妆品和保健食品中的一种重要多糖，提高发酵生产 HA 产量、拓展HA 的应用范围以及探索 HA 特性对应用的影响一直都是国内外研究的热点。透明质酸是一种市场前景广阔，经济效益好的高科技产品。目前，随着人民生活水平的逐步提高，透明质酸在高级化妆品、食品、药物等诸多方面的应用也日渐广泛，透明质酸产品需求量也在持续增长。在保健食品领域，日本、美国等一些发达国家掀起了HA 美容、保健食品的消费热潮。目前，我国关于HA 的食品、保健品的市场刚刚开始应用。2008年5月，我国国家卫生部按照《新资源食品管理办法》的规定发布相关公告，批准透明质酸钠作为一种新资源食品用于保健食品原料。随着HA 保健机理研究的进一步深入和保健功效宣传力度的加大，人们对含有HA 成分的食品认知度逐渐提高，透明质酸在食品中的应用前景十分广阔。
目前透明质酸（HA）的生产工艺主要分为两大类，以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。HA 在动物组织中的分布较为广泛，几乎所有的动物组织中均含有HA，只是含量不同。已从下列组织中分离出了HA：结缔组织、脐带、皮肤、人血清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉等，但考虑到原料HA 含量的高低、数量的多少和易于取得的程度等成本因素，能够用于生产的原料主要为鸡冠、人脐带和动物眼球。因此本设计主要研究微生物发酵法生产透明酸的工艺过程，旨在大大提高透明质酸的产量和质量。本设计的细菌发酵法是利用兽疫链球菌在生长繁殖过程中，向胞外分泌以 HA 为主成分的夹膜而形成的，与动物组织提取法相比，具有成本低，生产规模不受动物原料限制，发酵液中 HA 以游离状态存在，易于分离纯化和形成规模化工业生产，无动物来源的致病毒污染的危险等优点。各种来源的 HA 无种属差异，不同动物组织提取的及不同菌种发酵生产的 HA，在化学本质和分子结构上是一致的，只是相对分子质量（Mr）有差别。
之前人们对微生物发酵法生产透明酸的研究已经取得了很多进展，由于本设计的研究范围局限于实验室，因此本设计在总结了前人研究的基础上，着重研究摇瓶培养基组成对透明质酸发酵的影响和发酵条件对透明质酸产量的影响，采用正交实验设计，以确定最佳发酵条件，使兽疫链球菌发酵生产透明质酸的工艺达到最优化。
1.材料
1.1 试验用的仪器
仪器
厂商
型号
光学显微镜
上海光学仪器六厂
XSP-BM21AY
电热压力蒸汽灭菌器
上海申安医疗器械厂
LDZX立式
粘度计
上海箐海仪器有限公司
NDJ-8S
超净工作台
苏州安泰技术有限公司

电子天平
上海天平仪器厂
FA1004
pH 计
上海佑科仪器仪表有限公司
PHS-3C
可见分光光度计
上海佑科仪器仪表有限公司
721
电热恒温水浴锅
上海一恒科技有限公司
HWS - 24

1.2 试验药品
药品
厂商
兽疫链球菌株
北京微生物所
Tris-maleate缓冲液
上海君瑞生物技术有限公司
NTG 溶液
上海江莱生物科技有限公司
丙酮
天津市科密欧化学试剂有限公司
琼脂
北京奥博星生物技术有限公司
咔唑
北京笃信精细制剂厂
葡萄糖醛酸
Sigma 公司
透明质酸（医药级）
山东东晨生物技术有限公司
亚硝基胍
东京化成工业株式会社
2. 方法
2.1 细菌发酵法生产透明质酸的工艺路线
过滤
移种
培养

斜面菌种 摇瓶种子液 发酵培养 发酵液
解离
溶解
络合沉淀
醇沉淀

滤液 沉淀 溶液 HA-CPC沉淀 解
醇沉淀
脱水干燥

离液 沉淀 HA
2.2 兽疫链球菌发酵生产透明质酸的工艺流程
2.2.1 摇瓶种子液的培养
斜面菌种，接种于装有灭菌培养液400 mL 的1 L 摇瓶中，37 ℃ 培养12～16 h，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中。摇瓶培养液主要成分：淀粉、蔗糖、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、碳酸钙、K2HPO4等。本设计针对摇瓶培养基设计不同因素和水平，按照正交实验方案处理结果。
2.2.2 种子罐种子液的培养
按摇瓶种子液的配方配制培养液100 L，加入种子罐中，通蒸汽加热，115℃灭菌30 min。冷却至37 ℃，用火焰接种法，将摇瓶种子液接种于种子罐中，通气量50 L/min，搅拌转速120 r/min，37 ℃培养14～16 h。光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可待接种于发酵罐中。
2.2.3 发酵
按摇瓶种子液配方，将葡萄糖含量提高到5%，配制发酵培养液1000 L，加入1.4 m3发酵罐中，通入蒸汽加热，115 ℃灭菌30 min。冷却至37 ℃后，将种子罐中的种子液通过移种管道移至发酵罐中，维持通气量500～600 L/min，搅拌转速120 r/min，37 ℃发酵40～46 h。在发酵过程中，发酵液的pH 不断下降，加5 mol/L氢氧化钠溶液，调pH 6.5～7.0。发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5% 以下，pH 值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。
2.2.4 下游分离纯化
发酵结束后，用三氯乙酸调 pH 4.0～4.5，板框过滤除菌体，滤液用稀氢氧化钠调pH 6.0～6.5，加三倍体积95% 乙醇，沉淀出 HA。沉淀用与发酵液等体积的0.1 mol/L氯化纳水溶液溶解，在搅拌下，加入过量的1% CPC水溶液与滤液中的HA 发生络合沉淀，静置使沉淀下沉，虹吸出母液，加入0.1 mol/L 氯化钠液中搅拌解离过夜，过滤，滤液加三倍体积乙醇沉淀，沉淀用乙醇和丙酮脱水，用旋转式真空干燥器进行干燥，得到 HA。
2.3 检测方法
2.3.1 HA 含量的检测方法（Bitter-Muir 咔唑法）
原理：葡萄糖醛酸与沸腾的浓硫酸作用，脱羧反应形成戊搪，同时产生二氧化碳，二氧化碳与硼砂咔唑反应生成红色，在530 nm 处有最大吸收值，该吸收值与葡萄糖醛酸含量成线性关系。
标准曲线的制备：精密量取 100 μg/mL HA 标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于20 mL 具塞试管中，各加水至1.0 mL，混匀，冰浴中冷却，并在不断搅拌下缓缓加入硼砂硫酸溶液5.0 mL，密塞，沸水浴中加热 10 分钟，放冷。精密加入咔唑溶液0.2 mL，摇匀，沸水浴中加热 15 分钟，放冷。照紫外-可见分光光度法（中国药典2005年版二部附录 ⅣA），在 530 nm 波长处测定吸光度，以葡萄糖醛酸的μg 数（mg）对相应的吸光度计算回归方程（回归相关系数 ＞ 0.990）。
发酵液中 HA 待测样品液的制备：将 10 mL 的发酵液加入其 2 倍体积的酒精中，室温下搅拌后静止 30 min，离心，弃上清液，再加入 1 同体积蒸馏水，溶解，既得供式样品液。在实际测定时需要根据发酵液中的 HA 含量稀释一定倍数，使分光光度计度数在 0.2~0.8 之间。
测定：精密量取供试品溶液 1.0 mL 置具塞试管中，照标准曲线制备自“冰浴中冷却”起依该法操作，测定吸光度，从标准曲线上查出相应的葡萄糖醛酸质量（mg）。
计算：根据理论计算，HA 分子中葡萄糖醛酸的含量为 46.32%，故
HA (g/L) = 葡萄糖醛酸质量（g/L）÷ 46.32%
2.3.2 还原糖的测定方法—DNS法
取发酵液适当浓度稀释液(测定 OD 值最好在 0.2-0.8 之间)0.5 mL 于25×250 mm 试管中，加入0.5 mL DNS 试剂，同葡萄糖标准曲线操作，测吸光值。根据测得的 OD 值在标准曲线上查出相应的糖量，并按下式计算出发酵液中葡萄糖的含量。
葡萄糖含量（mg/mL）=（A/0.5）× n
式中：A—由标准曲线上查得葡萄糖的质量，mg；
0.5—吸取样品的量，mL；
n—稀释倍数。
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