GB∕T 40141-2021 榆韧皮部坏死植原体检疫鉴定方法.pdf

ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 40141-2021 榆韧皮部坏死植原体检疫鉴定方法Detection and identification of Candidatus Phytoplasma ulmi 2021-05-21发布国家市场监督管理总局申+国家标准化管理委员会保W2021-12-01实施GB/T 40141-2021 目IJ1=1 本文件按照GB/T1.1-2020(标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会CSAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、内蒙古农业大学、青岛海关技术中心、上海市农业技术推广服务中心。本文件主要起草人:赵文军、回茜、李正男、张红梅、牟海清、张京宣、罗金燕。I GB/T 40141-2021 榆韧皮部坏死植原体检疫鉴定方法1 范围本文件描述了榆韧皮部坏死植原体的检疫和鉴定方法。本文件适用于进出境榆树苗木及接穗中榆韧皮部坏死植原体的检疫和鉴定。2 规范性引用文件本文件没有规范性引用文件o3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 聚合酶链式反应polymerase chain reaction; PCR 以耐热DNA聚合酶和一对引物(与待测目标核酸分子序列同源的DNA片段)通过高温(DNA分子变性)和低温(引物和目标核酸分子复性并被耐热DNA聚合酶延伸)交替循环扩增待测目标核酸分子的方法。3.2 植原体phytoplasma 一类无细胞壁，尚不能人工培养，主要分布于植物韧皮部筛管细胞、刺吸式介体昆虫的肠道、淋巴、唾液腺等组织。4 榆韧皮部坏死植原体基本信息学名:Candidatus Phytoplasma ulmi 传播途径:依靠带病苗木进行远距离传播。榆韧皮部坏死植原体的其他信息见附录A。5 方法原理该病害主要危害榆树，依靠带病苗木进行远距离传播。其生物学特性和16S基因序列等分子生物学信息是该检疫鉴定方法的依据。16SrDNA相对保守，通过植原体通用引物R16F2/R16R2即可扩增获得植原体16SrDNA序列。6 仪器设备和主要试剂6.1 仪器设备PCR仪、超净工作台、灭菌锅、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡GB/T 40141-2021 器、移液器、电泳仪、凝胶成像分析仪。6.2 主要试剂PCR缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、PCR凝胶电泳检测试剂应符合附录B。除另有规定外，所有试剂均为分析纯。7 检测与鉴定方法7.1 症状观察仔细观察种苗是否表现植原体侵染症状，症状描述的信息见A.7o7.2 DNA 提取称取100mg含有韧皮部组织的植物材料，剪成小块放人研钵中，加人液氮，待样品冷冻完全后快速、用力研磨至粉状，随后直接用商业化植物基因组DNA提取试剂盒按照操作说明提取样品总DNA，一20oC保存备用。7.3 通用引物进行PCR扩增并测序利用植原体通用巢式引物R16mF1/R16mR1/R16F2/R16R2进行PCR扩增并测序，具体步骤应符合附录B。7.4 虚拟RFLP指纹图谱检测利用iPhyclassifier在线分析软件或DNA-FPCluster软件对7.3测得的植原体16SrDNA序列进行虚拟RFLP指纹图谱检测，具体步骤应符合附录C。8 结果判定表现症状与附录A描述一致可初步判定怀疑感染榆韧皮部坏死植原体，但需通过7.3、7.4进一步检测。在7.3检测中，若PCR产物凝胶电泳出现1200 bp左右条带，可初步判定感染榆韧皮部坏死植原体，经克隆测序及分析比对后，若与B.6中序列相似性大于97.5%，则可判定该样品携带榆韧皮部坏死植原体。在7.4检测中，将测得的植原体16SrDNA序列经17种限制性内切酶RFLP指纹图分析，若RFLP图谱与图C.1一致，则可判定该样品携带榆韧皮部坏死植原体o9 样品及检测结果保存9.1 样晶保存与处理样品经登记和经于人签字后妥善保存。对检出榆韧皮部坏死植原体的样品应保存于一70oC冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。9.2 结果记录与资料保存完整的实验记录包括:样品的来源、种类、送检时间，实验时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，需保存DNA序列和RFLP图谱。2 附录A(资料性)榆韧皮部坏死植原体其他信息A.1 名称与分类地位中文名:榆韧皮部坏死植原体学名:CldidtusPhytoplasma ulmi 异名:Elm yellows-associated phytoplasmas Illinois elm yellows phytoplasmas Elm phloem necrosis phytoplasma 英文名:Elm phloem necrosis phytoplasma GB/T 40141-2021 分类地位:细菌界CBacteria) ，厚壁菌门CFirmicutes) ，柔膜菌纲CMollicutes) ，非固醇菌原体目C Acholeplasmatales ) ，非固醇菌原体科CAcholeplasmataceae ) ，植原体候选属CCandidatus Phytoplasma) ，16SrV植原体组A.2 寄主植物该病害只能为害榆属的种类，主要包括美国本地的美国榆CUlmusamericana) ，红榆CU.rubra) , U.alata ，U.serotna和U.crassifolia，嫁接试验表明该病害还能为害欧亚地区的U.minor, U.laevis和棺时俞CU.arvifolia)。A.3 地理分布主要分布于北美洲地区北纬320到460，西经710到970之间。欧洲:捷克、法国、德国、意大利(广泛分布)。北美洲:加拿大(安大略湖)、美国(亚拉巴马州、阿肯色州、佐治亚州、伊利诺伊州、印第安纳州、艾奥瓦州、堪萨斯州、肯塔基州、马里兰州、马萨诸塞州、密歇根州、明尼苏达州、密西西比州、密苏里 州、内布拉斯加州、新泽西州、纽约、北达科他州、俄亥俄州、俄克拉何马州、宾夕法尼亚州|、田纳西州、弗吉尼亚州)。A.4 传播介体叶蝉COLiarusat走insoni)、冤丝子CCuscuta)等。A.5 形态学特性植原体寄生于植物韧皮部的筛管内，形态大小约500nm 1 000 nm，并能够通过细菌滤器，不具有细胞壁，呈现多型性，一般有球形、椭圆形、长杆形、梭形、带状和多态不规则形等多型性。由于生长周期不同，植原体呈现初生体、小球体、大球状体和丝状体等形态。A.6 为害情况受榆树韧皮部坏死植原体为害的植物根部组织大量增生肥大，组织纤维化并出现大量的根部坏死。这是植株感病后出现的最初症状，但是这种症状在地上部分出现明显的症状之前是很难观测到的。韧GB/T 40141-2021 皮部坏死的外部症状是有很大差异的。在美国北部，病害引起的第一次落叶一般发生在7月中旬至9月中旬，落叶中有发黄的叶片，有顶部的和l未成熟的叶片。一般来讲，感病植株所有枝条都会立即显症。有时候症状只会在植株某几个枝条上出现并扩散，而其他的枝条保持正常。但更多时候，枝条上的所有叶片都变成淡黄绿色到黄色。在生长季节的晚期，感病植株上的叶片呈现出一种比预期时间早的外观。这种黄化以及外观比起那些由于生长在岩石地区缺少肥料所引起的症状是完全不同的。显出生长晚期症状的感病植株有可能在下个生长季节不能够正常抽芽或者生长，最后导致死亡。A.7 症状特征在早春，感病植株显示出的外部症状主要是不能够正常产生叶片，或者产生一些最后萎焉变黄甚至脱落的小叶。春末的时候，那些正常生长出叶片的植株一般会迅速萎焉死亡，褐色干枯的叶片有可能在这些已死的叶片上附着几个星期。盛夏季节植株通常会枯萎，但是这种情况一年四季都有可能发生。总体上讲，一般病株枯死于侵染后的第二年。落叶前，病株的树干和根部韧皮部会形成黄褐色斑块。在一些巨大的树干上会形成一些垂直融合的巨大斑块。病株的形成层和木质部的表面也可能形成一些变色斑块，但是这些斑块一般不大于1 mm。如果在茎干表皮能够明显看到大块的黑色斑块，说明植株同时被感染荷兰榆树病和榆树韧皮部坏死病。暴露出来的病株韧皮部比健康植株更容易氧化褐变。红榆CU.rubra)、美国榆CU.americana)、挪榆CU.arvifolia)感病症状见图A.l图A.5。图A.1感病红榆CU.rubr)叶片变黄症状4 GB/T 40141-2021 图A.2感病美国榆CU.american)整株黄化症状注:左为健康枝条，右为发病枝条。图A.3感病美国榆CU.mericana)叶片黄化症状GB/T 40141-2021 图A.4感病挪榆CU.parvifolia)丛枝症状图A.5感病美国榆CU.americana)韧皮部坏死症状6 B.1 巢式引物序列植原体通用引物:附录B(规范性)PCR扩增与测序分析R16mF1,5-CATGCAAGTCGAACGGA-3 R16mR1,5-CTTAACCCCAATCATCGA-3 R16F2 , 5 -ACG ACTGCTGCT AAG ACTGG-3 R16R2 , 5 -TG ACGGGCGG TG TG丁ACAAACCCCG-3B.2 PCR反应体系2XPCR mix混合液12.5L，DNA模板2L，双蒸水1 1.5L。GB/T 40141-2021 取第一轮扩增产物1L，稀释10倍，取稀释产物2L为模板，进行第二轮扩增，反应体系同上。B.3 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照:以健康的榆树叶片DNA为模板。阳性对照:采用感病榆树叶片DNA为模板。空白对照:双蒸水。B.4 PCR的反应参数第 一对引物R16mFl/R16mR1:94 oc预变性10mi川940C变性305,52 oC退火455，720C延伸1 min，35个循环后于720C保温10min。第二对引物R16F2/R16R2:94 oC预变性10min;94 oC变性305,52 oC退火455,72 oC延伸min，35个循环后于72oC保温10min,4 oC冰箱中保存。洼:不同仪器可根据仪器要求对反应参数做适当调整。B.5 琼脂糖凝胶电泳制备2%的琼脂糖凝胶，以DNAMarker作为分子量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪观察并记录结果。B.6 序列测定分析当琼脂糖凝胶电泳显示在1200 bp左右有条带，对该条带进行克隆测序，并与GenBank中的登录号为FJ436792.lCCandidatusPhytopla5ma ulmi 16S ribo5omal RNA gene,partial 5equence长度1248 bp)进行序列比对。7 GB/T 40141-2021 附录C(规范性)虚拟RFLP指纹图i昔分析利用iPhyclassifier在线分析软件或DNA-FPCluster软件将测得的植原体16SrDNA序列(R16F2/R16R2)进行虚拟酶切，选用17种限制性内切酶CAluLBmH LBfa LBstU LDra LEcoR L Hae m、Hha1、Hi川I、Hpa1、HpaII 、KpnI,Mbo 1、Mse1、Rsa1 ，SsI、Taq1)。酶切后RFLP图谱如图C.1。此外，使用iPhyclassifier的组(亚组)划分功能(l6Srgroup/ subgroup classifi cation based on similarity coefficient) ，可以对未知植原体进行组与亚组的分类。DNA分子量标准选用Invitrogen25 bp DNA Ladder，琼脂糖凝胶浓度为3%，最小片段选为10 bp。8 标引序号说明:泳道1-Marker; 泳道2一-Alu1 ; 泳道3-BamH 1 ; 泳道4一-Bfa1 ; 泳道5-BstU 1 ; 泳道6一-Dra1 ; 泳道7-EcoR 1 ; 泳道8一-Hae囚;泳道9-Hh1 ; 泳道10一-Hinf1 ; 4 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 泳道11一-H1; 泳道12-HaIl; 泳道13一-K户n1 泳道14-Mbo1 ; 泳道15一-Mse1 ; 泳道16-R1; 泳道17一-Ss1; 泳道18-Taq1 ; 泳道19一-Marker。图C.1榆韧皮部坏死植原体虚拟RFLP指纹图谱GB/T 40141-2021 参考文献1J Lee, l,-M. , Martini, M. , Marcone, C. ,et al. Cassification of phytopasma strains in the em yeows group Cl6SrV) and proposa of Candidatus Phytopasma umi for the phytopasma associat ed with em yellows.lnternationa Journa of Systematic & Evoutionary Microbioogy,2004,54CPt 2): 337-347. 2J Zhao, Y. , Wei, W., Lee, l,-M. ,et al.Construction of an interactive online phytoplasma classi fication tool, i PhyClassifier, and its application in analysis of the peach X-disease phytoplasma group Cl6Sr田).International J ournal of Systematic & Evolutionary Microbiology, 2009, 59 C Pt 10): 2582-2593.