姜黄素致SW872脂肪细胞凋亡作用.pdf

3 Dubey JP，Shen SK，Kwok OC，et al Infection and immunity withthe RH strain of Toxopiasma gondii in rats and miceJ J Parasi-tol，2006，126:11 194Jones JL，Dubey JP Waterborne toxoplaasmosisrecent develop-ments J Exp Parasitol，2010，124:10 255 周永华，胡玉红，顾向明，等 弓形虫感染对大鼠记忆力影响及其机制的实验研究 J 中国人兽共患病学报，2009，25(2):152 1556 Hay J，Aitken PP，Graham DJ，et al Toxoplasma infection and re-sponse to novelty in miceJ Z parasitenkd，2001，70:575 5887 Powell SR，Wahezi SE，Maulik D The effect of in utero hypoxia onfetal heart and brain trace metalsJ J Trace Elem Med Biol，2002，16(4):245 2488 杨晓红，吴静，殷国荣，等 ESA 和 STAg 鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染作用 J 中国公共卫生，2009，25(3):292 2949 Celsis P，Agniel A，Cardebat D，et al Age related cognitive decline:a clinical entity?A longitudinal study of cerebral blood flow andmemory performanceJ J Neurol Neurosurg Psychiatr，2002，62:601 608收稿日期:2011-04-11(解学魁编辑宋艳萍校对)*基金项目:国家自然科学基金(30771805);黑龙江省博士后启动基金(LRB06 278)作者单位:哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，黑龙江 哈尔滨 150081作者简介:戴岭(1987 )，男，湖南岳阳人，硕士在读，研究方向:肥胖的营养防治。通讯作者:闻颖，E-mial:wenying_alice yahoo com cn【实验研究】姜黄素致 SW872 脂肪细胞凋亡作用*戴岭，吕鹏，白宇娜，郑佳，闻颖，孙长颢摘要:目的探讨姜黄素对 SW872 脂肪细胞凋亡的影响及其凋亡机制。方法MTT 法检测不同剂量姜黄素对SW872 前脂肪细胞和成熟脂肪细胞生长抑制的影响;4，6 二脒基 2-苯基吲哚(DAPI)染色观察姜黄素作用后成熟脂肪细胞内细胞核变化。蛋白印迹法检测聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)裂解产物和 Bcl-2-associated X protein(Bax)表达量。结果姜黄素对 SW872 前脂肪细胞及成熟脂肪细胞生长有抑制作用，并呈剂量 时间效应关系，不同剂量姜黄素作用成熟脂肪细胞 72 h，与对照组比较，抑制率分别为 2.97%、3.48%、19.76%、85.03%和 94.48%;DAPI染色镜下观察成熟脂肪细胞出现明显核皱缩、变形现象;随姜黄素剂量增加，PARP 裂解产物 Bax 蛋白表达量呈上升趋势(P 0.01)。结论姜黄素促进 SW872 脂肪细胞凋亡，凋亡机制与线粒体密切相关。关键词:姜黄素;Sw872 脂肪细胞;凋亡;PARP;Bax中图分类号:R 151.1文献标志码:A文章编号:1001-0580(2011)08-1012-02Effect of curcumin on apoptosis and its mechanisms in SW872 adipocytesDAI Ling，L Peng，BAI Yu-na，et alDepartment of Nutrition and Food Hygiene，Public Health College，Harbin Medical University(Harbin 150081，China)Abstract:ObjectiveTo explore the effect of curcumin on the apoptosis of SW872 adipocytes and the molecularmechanisms of the apoptosis MethodsThe proliferation potential of SW872 preadipocytes and mature adipocytes treatedwith different concentrations of curcumin were evaluated by methyl thiazol tetrazolium(MTT)methods The apoptosis ofSW872 mature adipocytes were determined with 4，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)staining Western blot was used todetect the expression of poly(ADP-ribolse)polymerase(PARP)cleavage and Bax ResultsCurcumin could significantlyinhibit the replication of SW872 preadipocytes in a dose-and time-dependent manner Curcumin could inhibit the viability ofSW872 mature adipocytes in a dose-and time-dependent manner We observed nuclear shrinkage and deformation in SW872mature adipocytes by DAPI staining Curcumin could cause the increases in PARP cleavage and Bax expression in a dose-de-pendent manner ConclusionCurcumin mediates adipocyte apoptosis via a mitochondrial pathway in SW872 adipocytesKey words:curcumin;SW872 adipocyte;apoptosis;PARP;Bax姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等多种生物学功能。近年来，研究表明姜黄素能诱导多种肿瘤细胞凋亡1 2，还有减轻肥胖大鼠体重作用3 4，但对脂肪细胞凋亡作用及其机制尚不十分清楚。SW872 前脂肪细胞为人源性脂肪细胞株，经诱导可分化为典型脂肪细胞。本研究探讨姜黄素对 SW872 成熟脂肪细胞凋亡的影响及其分子机制，为姜黄素临床应用提供基础数据。1材料与方法1.1主要试剂SW872 前脂肪细胞株(ATCC);Dulbeccosmodified Eagle media:nutrient mixture F-12(DMEM/F12)(美国ibco 公司);油酸(oleic acid)、油红 O、姜黄素(美国 Sigma 公司)。1.2方法1.2.1细胞培养、诱导分化及鉴定SW872 细胞置于 37，5%CO2培养箱中，用 DMEM/F12+10%胎牛血清培养，隔日换液，待细胞达 80%汇合后换为无血清 DMEM/F12 培养液，并加入 0.6 mmol/L 油酸作为诱导分化剂连续培养5，显微镜下观察细胞形态变化，油红 O 染色观察胞浆中脂肪聚集。1.2.2前脂肪细胞增殖采用四甲基偶氮噻唑蓝(methylthiazol tetrazolium bromid，MTT)法，将 SW872 前脂肪细胞以 1104个/孔接种于 96 孔板，DMEM/F12+10%胎牛血清培养，隔日换液，待细胞达 60%70%汇合，用无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)冲洗 2 次，加入不同剂量姜黄素(0、10、20、40、80 mol/L)作用 24、48、72 h(每组 12 复孔)，进行 MTT 检测。1.2.3成熟脂肪细胞生长抑制率检测采用 MTT 法，将2101中国公共卫生 2011 年 8 月第 27 卷第 8 期Chin J Public Health Aug 2011 Vol27 No 8书书书SW872 前脂肪细胞用 96 孔板培养，待细胞达 90%100%汇合，诱导成熟后，加入不同剂量姜黄素(0、10、20、40、60、80mol/L)作用 24、48、72 h 后进行 MTT 检测。1.2.44，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色脂肪细胞在0、10、40、80 mol/L 剂量姜黄素作用 24 h 后，以中性福尔马林在室温下固定 10 min，PBS 浸洗 5 min，滴加 DAPI 染液 5g/mL，室温下染色 10 min，用 PBS 振洗 3 次，荧光显微镜下观察。1.2.5蛋白免疫印迹检测(western blot)将细胞裂解，十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶，蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，依次置于 5%脱脂奶粉、PBS、一抗、二抗、和显色液中孵育，用计算机生物图像分析系统对干燥后PVDF 膜进行扫描，并用 Quality One 软件进行灰度值分析。1.3统计分析应用 SPSS13.0 软件进行数据分析，多组间比较用方差分析，两两比较采用 Dunnett(q)检验，P 0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1前脂肪细胞诱导分化油酸促进 SW872 前脂肪细胞的形态向成熟脂肪细胞转化。诱导分化 72 h 时，细胞呈戒环状，脂滴更多，油红 O 染色可见胞浆中明显的脂肪染色。2.2姜黄素对前脂肪细胞增殖影响(图 1)姜黄素能明显抑制 SW872 前脂肪细胞增殖，且有剂量和时间依赖性。在姜黄素处理 24h 后随着姜黄素剂量增加细胞生长抑制率基本呈线性增加，且随时间延长，各剂量组抑制率均有上升趋势。图 1姜黄素对 SW872 前脂肪细胞增殖抑制作用2.3姜黄素对成熟脂肪细胞生长抑制(表 1)与对照组比较，姜黄素能明显影响 SW872 成熟脂肪细胞生存，当姜黄素剂量40 mol/L 时，抑制率随剂量增加而增加，且随作用时间延长抑制率增加明显。DAPI 染色结果显示 40 mol/L 剂量组有部分细胞核发生变化，出现核皱缩变形，随剂量增加细胞凋亡现象明显。表1姜黄素对 SW872 成熟脂肪细胞生长抑制作用(%，n=6)组别(mol/L)24 h48 h72 h对照组000姜黄素102.582.092.97204.412.593.48409.27a10.75a19.76a6029.69a61.84a85.03a8044.76a76.09a94.48a注:与对照组比较，a P 0.05。2.4PARP 和 Bax 表达水平变化(图 2)不同剂量组 SW872成熟脂肪细胞均可检测到 PARP 蛋白全长 116 kDa 和特征性89 kDa 条带以及 Bax 蛋白 23 kDa 条带，各剂量组间 PARP 特征性裂解片段表达差异有统计学意义(F=151.252，P 0.01)，随姜黄素剂量增加，PARP 特征性裂解片段表达增加。当姜黄素剂量40mol/L，Bax 表达量逐渐升高，差异有统计学意义(F=163.507，P 0.01)。图 2姜黄素作用后成熟脂肪细胞内凋亡相关蛋白的表达3讨论肥胖是常见营养障碍性疾病，肥胖的产生既受到脂肪细胞体积大小影响，同时也受到脂肪细胞数目多少影响，而其数目减少可以通过脂肪细胞凋亡而实现。姜黄素是中药姜黄的主要活性成分，是一种脂溶性酚类色素，能够导致 116 kDa 的PARP 蛋白破裂、89 kDa 裂解产物增加6，而 PARP 裂解片段的表达是凋亡发生的标志物之一。同时，姜黄素诱导的凋亡与促凋亡蛋白 Bax 的释放相联系7。近年研究表明，姜黄素对人恶性黑色素瘤细胞 A375、人胃癌细胞 SGC 7901、人膀胱癌细胞 T24、人胃癌细胞 MKN-45、人卵巢癌细胞 A2780 等多种肿瘤细胞具有明显抑制作用8，但其对脂肪细胞的影响则报导较少。本研究结果表明，姜黄素能抑制 SW872 前脂肪细胞数目增加，同时对成熟脂肪细胞有凋亡作用，随姜黄素剂量增加，PARP 蛋白裂解产物和 Bax 蛋白表达量也逐渐增加。提示姜黄素能够促进成熟脂肪细胞凋亡，并且与促凋亡蛋白 Bax 释放相关联，而 Bax 是 Bcl-2 家族中一员，它在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用。因此，姜黄素促凋亡机制可能与线粒体密切相关，但具体凋亡通路还有待进一步探讨。参考文献1 Sarkar FH，Li Y，Wang Z，et al Cellular signaling perturbation bynatural productsJ Cell Signal，2009，21(11):1541 15472 姜丽平，姜丽杰，杜伯雨，等 姜黄素诱导人结肠癌细胞凋亡作用J 中国公共卫生，2005，21(9):1084 10863 Weisberg SP，Leibel R，Tortoriello DV Dietary curcumin significant-ly improves obesity associated inflammation and diabetes in mousemodels of diabesityJEndocrinology，2008，149(7):3549 35584 Ejaz A，Wu DY，Kwan P，et al Curcumin inhibits adipogenesis in3T3-L1 adipocytes and angiogenesis and obesity in C57/BL miceJ J Nutr，2009，139(5):919 9255 卢慧玲，王宏伟，Cianflone K，等 诱导 SW872 前脂肪细胞分化的最优方法探讨J 基础与临床，2006，26(3):315 3186 Yang JY，Della-Fera MA，Nelson-Dooley C，et al Molecular mecha-nisms of apoptosis induced by ajoene in 3T3-L1 adipocytesJ O-besity(Silver Spring)，2006，14(3):388 3977 Yang JY，Della-Fera MA，Baile CA Esculetin induce mitochondria-mediated apoptosis in 3T3-L1 adipocytesJ Apoptosis，2006，11(8):1371 13788 刘海龙，洪行球 姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展J 现代生物医学进展，2007，7(7):1108 1109收稿日期:2011-04-01(解学魁编辑宋艳萍校对)3101中国公共卫生 2011 年 8 月第 27 卷第 8 期Chin J Public Health Aug 2011 Vol27 No8