柱色谱分离实验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,柱 色 谱,Column Chromatography,1,了 解：,1.柱色谱法分离有机物的原理。,2固定相和流动相的选择原则。,掌 握：,1.色谱柱的填充方法。,2柱色谱分离的基本操作。,一、实 验 目 的,2,色 谱 法 简 介,色谱法亦称色层法，层析法等，是,分离，纯化和鉴定,有机化合物的重要方法之一，还可,定量分析,。,3,色谱法分类,固定相、流动相的物理状态,操作形式,分离原理,液固色谱法,气固色谱法,气液色谱法,液液色谱法,柱色谱法（,column chromatography,）,薄层色谱法（,TLC,）,纸色谱法（paper chromatography）,气相色谱（,GC,）,高效液相色谱（,HPLC）,吸附色谱法,分配色谱法,离子交换色谱法,排阻色谱,操作形式,柱色谱法（,column chromatography,）,二、实 验 原 理,4,5,柱色谱分离示意图,混合物,吸附剂(固定相),洗脱剂(流动相),二、实 验 原 理,6,7,二、实 验 原 理,吸附剂的性质：,均匀、表面积大、不反应、吸附能力不同,化合物的结构：,化合物的吸附性和它们的极性成正比,洗脱剂的极性：,溶解度适中、不反应、易获取回收,影响分离效果主要因素,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,和,和,在氧化铝柱子上若分离下列各组混合物，哪一个组分先被洗脱下来？,21,三、实 验 内 容,装柱,加样,洗脱,收集,鉴定,干法：,10g,硅胶,+,乙醇,先用乙醇,后用水,操作,组分颜色,组分颜色,1mL,样品,加样操作,0.5mL2,乙醇洗涤,柱色谱操作,：,实 验 步 骤:,22,吸附剂装填紧密，排除气泡。最终应使吸附剂的上端平整，无凹凸面，无断层。,干法装柱,湿法装柱,装 柱,三、实 验 内 容,23,装柱时应该注意,均匀，不能有气泡，裂缝，否则样品可能顺缝隙流动而不吸附，影响样品的分离，应用质软的物体如吸耳球等轻轻敲击柱身，促使吸附剂装填紧密，排除气泡。最终应使吸附剂的上端平整，无凹凸面,24,样品为液体，可直接加样；样品为固体，可选择合适溶剂溶解为液体再加样。加样时，要沿管壁慢慢加入至柱顶部，勿使,样品搅动吸附剂表面,。,加 样,三、实 验 内 容,25,洗 脱,在柱顶不断加入洗脱剂，使洗脱剂,永远保持有适当的量，不要让洗脱剂表面流干,，使流动相流速适当。,三、实 验 内 容,26,洗脱,时应注意：,（,1,）向柱内加入,95%乙醇,溶液洗脱（可以通过注射器沿管壁或安装滴液漏斗）在恒压或加压条件下进行洗脱。控制流出速度,1滴/秒,。逐渐出现色层带分离。,（,2,）第一色层带到达色谱柱底部时，立即用锥形瓶收集第一色层的溶液，直到其完全被洗出。,【注意】洗脱时切勿使溶剂流干！,（,3,）然后，改用,水,溶液作为洗脱剂，当第二色层带到达色谱柱底部时，立即收集第二色层的的溶液，直到其完全被洗出。,（,4,）用量筒分别量取所分离出来的两种溶液的体积后，倒入指定的回收瓶中。,（,5,）分离结束后，应先让溶剂尽量流干，然后倒置，用吸耳球从活塞,向管内挤压空气，将吸附剂从柱顶挤压出。使用过的吸附剂倒入垃圾桶里。,27,试样有色,，在层析柱上可直接观察。洗脱后分别收集各个组分。,收 集,试样无色，,收集洗脱液时，多采用等份收集，每份洗脱剂的体积随所用吸附剂的量及试样的分离情况而定。收集的每份洗脱剂的体积越小，分离效果越好。,三、实 验 内 容,28,三、实 验 内 容,鉴 定,试样有色,依据颜色直接鉴定,试样无色,可结合薄层色谱结果,29,玻砂防堵塞,装柱需紧密,加压不可大,溶剂勿流干,四、注 意 事 项,30,色谱法在有机化学中的应用:,分离混合物,精制提纯化合物,利用比移值(R,f,)鉴定化合物,跟踪反应进程,小 结,31,色谱法的特点:,分离效率高,复杂混合物,同系物,异构体等。,灵敏度高,可以检测出,g,g,-1,(10,-6,)级甚至ng,g,-1,(10,-9,),级的物质量。,分析速度快,几分钟或几十分钟内可以完成一个试样分析。,小 结,32,柱色谱法分离甲基橙和甲基蓝,33,实验原理,甲基橙和亚甲基蓝均为指示剂,它们的结构式如下所示:,甲基橙,亚甲基蓝,由于甲基橙和亚甲基蓝的,结构不同,极性不同,吸附剂对它们的吸附能力不同,洗脱剂对它们的解析速度也不同,极性小、吸附能力弱,、,解析速度快的,亚甲基蓝先被洗脱下来,，而,极性大、吸附能力强,、解析速度慢的,甲基橙后被洗脱下来,，从而使两种物质得以分离。本实验以硅胶为吸附剂，,95%,乙醇作为洗脱剂，先洗出亚甲基蓝，再用蒸馏水作洗脱剂把甲基橙洗脱下来。,34,三、实 验 内 容,装柱,加样,洗脱,收集,鉴定,干法：,10g,硅胶,+,乙醇,先用乙醇,后用水,操作,组分颜色,组分颜色,1mL,样品,加样操作,0.5mL2,乙醇洗涤,柱色谱操作,：,实 验 步 骤:,35,仪器和试剂,1.仪器,锥形瓶、玻璃漏斗、色谱柱,2.试剂,柱层析硅胶、脱脂棉、乙醇（95%）甲,基橙、亚甲基蓝。,H,2,O95%乙醇=11(A液),0.2molL,-1,HCl95%乙醇=11(B液),36,装置图,装柱,洗脱,37,实验步骤,装柱,：,1、装色谱柱：,（1）取一支色谱柱，在柱子的收缩部塞一小团脱脂棉花将色谱柱垂,直固定在铁架台上。,(2)关闭活塞，向柱中倒入蒸馏水（也是洗脱剂，至柱体积的,1/2）,（3）填吸附剂：称取10g硅胶于小烧杯中,加入15mL蒸馏水,用玻,璃棒调好通过漏斗慢慢装入玻璃柱,使其逐渐沉入底,部。用洗耳球敲打柱身,使,硅胶,装填紧密，,打开活塞，用小锥型,瓶承接,控制滴速为1 滴秒,装完后在上面,加一层脱脂棉,（,，,操作时要注意吸附剂始终不能露出液面）。,38,实验步骤（续）,加样：,当液面刚好流至脱脂棉平面相切时，立刻关闭活塞，加入5mL左右的A液,当硅胶面又将要露出时,关紧活塞,用量筒准确加入0.50mL以A液做溶剂的混合液(含甲基橙和亚甲基蓝各为0.400gL-1)。,洗脱：,待此混合液将要渗入柱内时,立即用A液洗脱,此时可以观察到有鲜明的黄、蓝两条色带形成。黄色的甲基橙色带随洗脱剂的加入不断下移,而其顶部蓝色带不移动,当黄色带到达柱底部时,更换接受器,全部收集此黄色带,洗脱时间约10min。此后改用B液做洗脱剂,这时可看到蓝色带开始下移,当亚甲基蓝色带到达底部时,更换接受器,全部收集此蓝色带,洗脱时间约30min。,39,