西北农林科技大学生物技术虚拟实验.docx

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生物技术虚拟实验报告棒曲霉抗菌肽基因的克隆和蛋白纯化姓名：罗网班级：生物工程132班学号： 2013015383 指导老师：张大鹏 1. 研究目的抗菌肽（antimicrobial peptide，AMPs）是有机体在真核生物的核糖体和原核生物非核糖体合成的一类小分子碱性多肽（马文山等 2008），多有广谱抗菌活性，为大多数生物对入侵病原体的自然防御系统的重要组成部分，具独特的抗菌作用机制，可迅速杀菌，且不易引发细菌的耐药性，传统的抗生素通常是针对单一的酶来控制代谢途径，容易引起细菌的耐药性（Mangoni and Bhunia 2016）。最早被发现的抗菌肽是由瑞典科学家G.Boman等（1972）在惜古比天蚕体内注射E.coliK12D31产生的，定名为Cecropins。后来，人们相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物中发现并分离获得具有抗菌活性的多肽（Hale and Hancock 2007）。细菌、真菌、霉菌等微生物中均发现有抗菌肽，其中，细菌抗菌肽包括阳离子肽和中性肽，G+菌和G-菌均有分泌，且已发现的抗菌肽有杆菌肽（bacitracin）、短杆菌肽S（Sgramicidin）、多黏菌素E（Epolymyxin）、乳链球菌肽（nisin）等4种类型（贾素珍和路福平 2000）。本文拟经虚拟实验，克隆棒曲霉基因（Aspergillus clavatus）的AFP抗真菌蛋白序列，构建原核表达载体，并进行蛋白的表达和纯化。 2. 研究流程图 3. 实验设计 3.1 查询抗菌肽基因序列图 1 搜索目的基因在NCBI的nucleotide数据库中查找棒曲霉抗菌肽基因,筛选得到fasta格式的非冗余序列。图 2 导出FASTA文件得到的序列为：XM_001267786 ATGAAGGTCGTTTCTCTCGCTTCTCTGGGTTTCGCCCTCGTCGCTGCCCTTGGCGTGGTAGCCAGCCCCGTGGATGCCGATTCTCTCGCCGCAGGTGGTCTGGACGCAAGAGACGAGAGCGCCGTTCAAGCCACATACGACGGTAAATGCTACAAGAAGGACAATATCTGCAAGTATAAGGCACAGAGCGGCAAGACGGCCATTTGCAAGTGCTATGTCAAAGTGTGCCCCCGAGACGGCGCGAAGTGCGAGTTTGACAGCTACAAGGGCAAGTGCTACTGCTAG 图 3检索开放阅读框 3.2 寻找开放阅读框在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi上搜索ACCESSION号，得到ORF区域，+1囊括了整个全长基因。 3.3 寻找载体图 4 pUC57载体示意图在http://addgene.org/vector-database/网站中进行搜索pUC57载体，得到该载体的相关信息。载体序列全长为： 1 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg 50 51 gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg 100 101 tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 150 151 cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 200 201 ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt 250 251 caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 301 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta 350 351 acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 400 401 cgagctcggt acctcgcgaa tgcatctaga tatcggatcc cgggcccgtc 450 451 gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg taatcatggt catagctgtt 500 501 tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg 550 551 gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 600 601 ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 650 651 ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 700 701 ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 750 751 cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 800 801 cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 850 851 aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 900 901 ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 950 951 gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 1000 1001 ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 1050 1051 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 1100 1101 gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 1150 1151 aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 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ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 2000 2001 ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 2050 2051 ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 2100 2101 agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca 2150 2151 taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 2200 2201 agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 2250 2251 tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 2300 2301 aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 2350 2351 tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 2400 2401 tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 2450 2451 aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 2500 2501 gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 2550 2551 tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 2600 2601 aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 2650 2651 aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 2700 2701 ccctttcgtc 2710 在NCBI网站上保存为.gb格式图 5 将载体序列保存为gb格式 3.4 使用Vector NTI软件进行管理图 6 管理本地数据库里的序列管理所使用的载体和目的基因序列 3.5 酶切位点分析使用Primer Primer 5.0进行分析。输入基因序列，添加待用载体上的酶切位点，分析酶切位点，图说明该序列中无需要避免的位点。图 7分析酶切位点得到的结果预计在EcoRI和BamHI这两个位点之间进行酶切。 3.6 设计引物图 8 两端引物的设计先是用Primer Primer 5.0进行尝试，但是得到的评分很低，最高只有80多，所以最后还是用NCBI进行设计。退火温度一个是60.03°C，一个是57.93°C，相差不太大。加上酶切位点和保护序列。BamHI：CGCGGATCCGCG；EcoRI：CCGGAATTCCGG。上游引物序列：CGCGGATCCGCGATGAAGGTCGTTTCTCTCGCTT；下游引物序列：CCGGAATTCCGGCTAGCAGTAGCACTTGCCC。图 9 载体上两个酶切位点之间的序列图 10 载体插入目的基因序列插入到载体中，构建完整的表达载体。构建好之后，再使用凝胶电泳进行分析，判断是否插入到载体上。利用Vector NTI的模拟电泳功能进行操作。结果显示目的基因成功插入载体中。 3.7 扩增使用CaCl2将大肠杆菌制备成感受态，用热激法或电转法将载体导入大肠杆菌中。pUC57质粒具有氨苄青霉素抗性，可以用选择培养基筛选出转化成功的大肠杆菌菌落。涂板培养大肠杆菌，使其增殖，数量变得较多时进行挑菌，经超声处理，溶菌酶作用等破碎细胞，离心先粗提纯蛋白，然后粗分的产物经过凝胶过滤层析，阳离子交换柱层析等步骤之后，得到纯化的蛋白，最后进行SDS-PAGE检测鉴定蛋白。合成的蛋白序列： mkvvslaslgfalvaalgvvaspvdadslaaggldardesavqatydgkcykkdnickyaqsgktaickcyvkvcprdgakcefdsykgkcyc，分子量9771。 4. 参考文献贾素娟,路福平. 2000.生物抗菌多肽.氨基酸和生物资源, 22(4):5~8. 马文山,廖富蘋,范雪云,战伟.2008.细菌抗菌肽的研究进展及其应用.生物技术通报, (3) :39~43． Boman H G, Nilsson I, Rasmuson B.1972.Inducible antibacterial defence system in Drosophila. Nature, 237(5352):232~5. Hale J D,Hancock R E.2007.Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria.Expert Rev Anti Infect Ther,5(6):951~959 Mangoni M L, Bhunia A.2016.Editorial: Antimicrobial Peptides in Medicinal Chemistry: Advances and Applications. Current Topics in Medicinal Chemistry,16(1):398~421.

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