新编课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,课题,2,土壤分解尿素的细菌的分离与计数,课标领航,1,举例说明什么是选择培养基，并研究培养基对微生物的选择作用。,2,设置重复组和对照组，对土壤中分解尿素的细菌进行分离和计数。,【重点】,选择培养基的作用。,【难点】,菌落数目的统计。,课题背景,1,、尿素的利用,尿素,是一种重要的,农业氮肥。,尿素,不能直接,被农作物,吸收。,土壤中的细菌将尿素,分解成氨,之后才能被植物利用。,2,、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们,能合成脲酶,一、研究思路,(,一,),筛选菌种,1,实例：,寻找耐高温的,DNA,聚合酶,启示：,DNA,多聚酶链式反应,是一种在体外将,少量,DNA,大量复制,的技术，此项技术要求使用,耐高温（,93,0,C,）的,DNA,聚合酶。,寻找目的菌种时要根据它对,_,，到相应的环境中去寻找。,生存环境的要求,耐高温,的酶,耐高温,生物体,耐高温,环境（热泉、火山口）,寻找,寻找,Taq,细菌,筛选原因,:,因为热泉温度,70,80,0,C,，淘汰了绝大多,数微生物只有,Taq,细菌被筛选出来。,2,实验室中微生物的,筛选原理,人为提供,有利于目的菌株生长,的条件,(,包括营养、温度、,pH,等,),，同时,抑制或阻止其他微生物,生长。,该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？,碳源,：葡萄糖、尿素,氮源,：尿素,思考：,从物理性质看此培养基属于哪类？,从功能上属于哪类培养基？,固体培养基,选择培养基,此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,原则上能。,培养基的,氮源为尿素,，只有能合成,脲酶,的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。,缺乏,脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,3,选择培养基：,在微生物学中，将允许,_,，同时,_,生长的培养基。,特定种类的微生物生长,抑制或阻止其他种类微生物,4,要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，,包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基,方法：,抑制大多数微生物生长,造成有利于该菌生长的环境，,结果：,培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。,（,1,）将土壤中的固氮菌分离出来,（,2,）将土壤中自养微生物分离出来,举一反三,（,3,）筛选出抗青霉素的微生物,（,4,）筛选出耐高浓度食盐的微生物,不加氮源的无氮培养基,不加含碳有机物的无碳培养基,加入青霉素的培养基,加入,高浓度食盐,的培养基,思考：,怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为,唯一氮源,的培养基,牛肉膏,蛋白胨,培养基,是,分离,尿素,细菌,判断该,培养基,有无选,择性,实验组,对照组,培养基类型,是否,接种,目的,结果,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,如何对细菌进行计数？,1,显微镜直接计数：,利用,血球计数板(,血细胞计数板,）,，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,缺点,:,不能区分死菌与活菌；,不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,2.,间接计数法（,活菌计数法）,原理：,在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的,一个菌落,是由,一个单细胞,繁殖而成的，即,一个菌落代表原先的一个单细胞。,常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数,(CV)M,其中，,C,代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，,V,代表涂布平板时所用的稀释液的体积,(ml),，,M,代表稀释倍数。,(,二,),统计菌落数目,方法,运用,稀释涂布平板法,来,统计,样品中的,活菌,数。,原理,1,个菌落,1,个活菌,选择菌落数在,30,300,的平板上计数。,需培养计算出,三个或三个以上,的平板菌落求,平均数,。,统计的菌落往往比活菌的实际数目,低,。,注意事项,看课本,P22,，并讨论你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,第一位同学：没有,重复实验,（至少涂布,3,个平板）,第二位同学：,A,组结果误差过大，不应用于计算平均值,计算公式：,某同学在稀释倍数为,10,6,的培养基中测得平板上菌落数的平均数为,234,，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为,0.1ml,）,(),A.2.3410,8,B.2.3410,9,C.234,D.23.4,B,(,三,),设置对照实验,阅读,P22,23,页,“,（三）设置对照,”,一段讨论教材中提出的问题。,设置对照的目的：,排除实验组中非测试因素对试验结果的影响，提高实验结果的可信度。,(1)A,同学出现此结果的可能原因？,土样不同,培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),(2),设置对照实验，帮助,A,同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？,小结：这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少,方案一：,由其他同学,用与,A,同学相同土样,进行实验,方案二：,将,A,同学配制的培养基在,不加土样,的情况下进行培养，作为,空白对照,，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：,如果结果与,A,同学一致，则证明,_,；如果结果不同，则证明,A,同学存在,_,_,A,无误,操作失误,或培养基的配制有问题。,实验流程：,样品稀释涂布平板,微生物的培养与观察,菌落计数,二、实验设计,土壤取样,制备培养基,（一）土壤取样,从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。,先铲去表层土,3cm,左右,，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,土壤,“微生物的天然培养基”,土壤中的微生物数量最大、种类最多,大约,70%90%,是细菌,取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在,使用前都要灭菌。,（二）制备培养基,制备,选择培养基（尿素为唯一氮源）,制备,牛肉膏蛋白胨培养基,相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显,多于,选择培养基上的数目，因此，,牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了,选择,作用。,（对照作用）,思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？,（三）样品稀释涂布平板,稀释倍数为,10,1,10,6,。每个稀释度均用,3,个选择培养基,和,1,个蛋白胨培养基,。,.,取样涂布,实验时要对,培养皿作好标记,。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,分离不同的微生物采用不同的稀释度,稀释倍数,目的,细菌,10,4,、,10,5,、,10,6,保证获得菌落数在,30,300,之间、适于计数的平板,放线菌,10,3,、,10,4,、,10,5,真菌,10,2,、,10,3,、,10,4,原因：不同微生物在土壤中含量不同,.,微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔,24h,统计一次菌落数目。,选取菌落数目稳定时的记录作为结果，,以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。,细菌：,30,37,培养,1,2d,放线菌：,25,28,培养,5,7d,霉菌：,25,28,的温度下培养,3,4d,。,如果得到了,2,个或,2,个以上,菌落数目在,30,300,的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果,同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确,，需要重新实验。,微生物的培养与观察,一,无菌操作,1,、取土用的,小铁铲,的盛土样的,信封,在使用前都需要,灭菌,。,2,、应在,火焰旁,称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。,3,、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在,火焰旁,操作。,二,做好标记,注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。,三,制定计划,三、操作提示,四、结果分析与评价,1.,培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？,对照的培养皿,无菌落说明培养基没有污染,。,牛肉膏培养基的,菌落数目多余选择培养基的菌落数目,，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,四、结果分析与评价,2.,获得某一稀释度下，菌落数,30,300,的平板，在这以稀释度下,是否至少有两个平板的菌落数相接近？,相接近，说明操作成功。,五、课题延伸,1.,在以,尿素,为唯一氮源的培养基中加入,酚红指示剂,。培养某种细菌后，如果,PH,升高，指示剂将,变红,，说明该细菌能够分解尿素。,2.,测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到,伊红,-,美蓝,培养基上培养，大肠杆菌,菌落呈现黑色,，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。,大肠杆菌呈 黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊,红美蓝琼脂,(EMB),上典型特征,本课题知识小结,:,巩固练习,1.,使用选择培养基的目的是（）,A.,培养细菌,B.,培养真菌,C.,使需要的微生物大量繁殖,D.,表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别,2.,能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是,(),A.CO,2,和,N,2,B.,葡萄糖和,NH,3,C.CO,2,和尿素,D.,葡萄糖和尿素,C,D,3.,下列说法不正确的是（）,A.,科学家从,70,80,度热泉中分离到耐高温的,TaqDNA,聚 合酶。,B.,统计某一稀释度的,5,个平板的菌落数依次为,M1,、,M2,、,M3,、,M4,、,M5,，以,M3,作为该样品菌落数的估计值。,C.,设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度,D.,同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。,4.,为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）,A.,较多的氮源物质,B.,较多的碳源物质,C.,青霉素类药物,D.,高浓度食盐,B,C,