NY∕T 556-2020 鸡传染性喉气管炎诊断技术[农业].pdf

ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准NY /1 556-2020 代样NY门、55(-2002鸡传染性喉气管炎诊断技术Diagnostic techniques for avian infectious laryngotracheitis 2020 -11-2发布2021-04-01实施T了中华人民共和国农业农村部发布NY / T 556-2020 Ji:J1II )缩回再说(.!hI.t3飞n: 一-J，:JJII了流行州学、临床j，:状、ifl脸变化(见Z(?i:); -1:1)111了实验在诊断样Ilh采集(见第5.i;iJ;-J:01ll ( x电传染性收气1炎J，i:i PCR检测力法(j组9 :江), J， )111丁鸡传染的l收气价炎11J，lI尖光trl:PCR检曲!lJit去(见141101;0:I币i)1IIT珍断， i*(1让步IJi(.!hI.百111京) 。iJl t主.01正文件的某些内容f能涉及ft丰IJ0本文件的:&;(Ii机构不尽十IUJOJIJ运均利的dL本标W111农业农村iijl在牧(:-lxJJ-Wlll，0 4、标1fI111:J:1叫411物IlJc:标fI化技术委员会(SAC/TC181)V-I-Io 本标111起，(yl位中IJWl物Iltj Ji行病学中心。本标II起i，(人:蒋文191、文J圳、1-才;有、fl出慧、乍1111、中5金、|王、l丁的?的、彭扫、Xi.)(;1挝、役jt， Jnil叶、俯，i:、孙淑芳、刘华恼。斗、标illU!Ji代料:标准的历次版本农布t，i况为:N Y /1 556 2002。NY /1 556-2020 引1马传到.ttIlK气价炎CAvianinrcctious laryngotracheitis, AIIIT)是-;p)，FH痕珍病南亚非|1韧的阴q:-g;.，I 型引起的Xf)1呼吸:hll以病.也可感染llrx鸟、IIIX马平11孔雀。该!i与传J币快，死亡率较日，lttHil为H于l吸闲涌，吆11款，咳出含有Ifll液(I(Jr?;:1:1物，I部和气节到i!)且)，)，)长、:1:IfilJi形成膝烂。|才前网内主要使用i;ri疫前进行免疫，这些前疫苗HI力行通i偏才茧，接和)，后反应大.而且这些授前与m:jJJ:株一样也能导致持续感染。111 r*病Ilfli床)，1状，fn观察到的病丑Il变化差异很大，免疫鸡1iPIf州市或者病蒜i骨伏!这染1!li不表现临床J，刃，激泪后可造成发病，xfl以与其他1呼吸.ill疾病区)1).!ifn诊后Zill行实驹空中在测，通常检测病尿。近年来，)内外鸡传染UII侠气管炎诊断技术发展迅速。一些更为简便早11削价的诊断新技术已经成为鸡传染性l收气岱炎珍il9i平!I预防的lf(!X依据。本标lfI的修J参怒了。11:(院l&YJ物诊断试盼和疫苗标1fI于JJt )( 2016 )阪).j122tf?我|玛利l关技术。f究新成果修订，在技术上与网际先ill技术保恃致。II NY /1 556-2020 鸡传染性喉气管炎诊断技术1 范围-1机j;lfI规定了鸡传染性IIfX气笛炎的临时(E状、州高分肉、1111.i 1刷1J!J帝，JJjJI1免疫扩Ilt:it!j、发介闹式反!但(PCRl平11荧元定哨PCI5.但死亡斗较低，为IO%:lO%。4. 2 3 慢性型或温和型4. 2. 3. 1 突发I孩嗽和气l咄.11有口，QOHJI产ili下降。4.2.3.2 :&病率仅为1%2%.但大部分的感染发州则放终会冈窒息HIf:lo4. 3 由j检变化(19版本适川rf本文fl。1cid-et hylcnc NY /T 556-2020 4.3. 1 最急性型倒有1111.凝块的出的比l气岱炎，刻1液创肌炎，价;r气怡分布仰i1(ll裂l液。4.3.2 亚急性型气笆1.有fWIfll.l1不的，I(Jl (1)裂皮例渗L1物，在l收平11气位上部斜眼L附司j:11tI1包纤维京性下JiI样出版。4.3.3 慢性型或温和型4. 3. 3. 1 可见气管、H候和口/t:;1);1平fIIJI拉样和1干西各样的w死斑;f111ill塞物。4.3.3.2 刹时可仅有去，1，腺炎、炎和剥液机气岱炎。4.4 结果判定价合七述流行病学、IIfi床症状和阳l检变化的!i:)例，可安1)为疑似鸡传染利叫去气diFJ炎。确诊.采集有Ilti床症状鸡的组织或1(11.I进行实驹室诊断。5 实验室诊断样品采集5.1 器材5. 1. 1 于术必刀和银子。5. 1. 2 Tt心筒。5. 1. 3中YlJdt仿H-(:1;0 5.1.4纤l!JJ直rrN0 5. 1.5采1(ll器。5. 2 ttJl) 5.2. 1 )二卫H1i1.水，问己)YIIfJ;在A I(IJ A. 10 5. 2 2 1;矶举。5.23 链斗吕京。5. 3 样品采集5.3. 1 生物安全措施样品采集、保存与运输按照NY/丁51J的热执行。5.3.2 组织病料采集5.3. 2. 1 的禽采样m火m十lil拭子深入口JlI或气岱采tt分泌物(以气管为11).放入含15苟dK000 IU/ mL利ltJ11豆东4mg/mL (11无I，jg二JJHik水1.。也可用桥!拭子刮取|恨分泌物，处理方法同I5. 3. 2 2 病死禽采样元菌采JfI.病死鸡喉头和l气岱.放入元闹的平IIIli.密封保存。5. 3. 3 血清样品采集tf翅jf(t脉采集鸡1(ll液，句;4应小少于1mL二t菌分TliL!fll1斤，装入2ml离心价中.ll*I:才月二;2C-8C冷版或20C冷阶、保存。5.4 样品处理5.4. 1 柑!拭子样liIt经，:I)?!振荡后.10000r/min TiS心10min.取U，I液作为接种材料。5.4.2 组织样品元两条例下将组织j碎，按1: 1川人生理航水1(1.草案1000 IU/mLlIf吐:i东1mg/ mU后组织研磨圳市1)nl:二j浆，反复冻融2次-3次10000r/min离心10min.!仅上1i浓作为战利布l检测材料。6 病毒分离6. 1 器材6. 1. 1 组织创!黯RL6. 1.2 m l，jy.化衍。2 6. 1 3 pJJ式HH:ili片。6. 1 4 fl式lIE速IZi心机。6.1 5 冰衍(2C-8C和20.: )。6. 1. 6 SPF;(乌JI五。6. 1. 7 111-1利必a6 1.8 饭子。6. 1 9 ，1心12.6.2 试剂6 2. 1 j:)lliiluJ ( !J.!.人J).6.2.2 0.015 mol/ L pl-l 7 6.2 3 ， n:J，隶。6. 2 4 链￥吕京。6 3 鸡胚接种6.3. 1 月itUMI:且，, 孵仔。6. 3. 2 1吐11夕t亡的Afj脏、和l6. 3.3布，6.3.4 X.jJlf绒毛l展也6. 4 7 7. 1 器材7. 1. 1 军事f支器(10 7. 1. 2 :l7C站汹fi7.1.3火l:i价。7. 1 4 元山l注射?*(1 mL) 7.2 试剂7.2. 1 10川龄-1211龄SPF;(jJl伍。7.2.2 灭的的标illiIII1(11 m ( 1味11效价1101 7，23析、刊IdlfWllf1Li,i 7.2.4生JI1击JUKo7 3 试验步骤IY /T 556-2020 ,:1: F37C l、-168h I) -12门龄的nfk气岱炎7.3. 1 守j，iI在分同物川介lY衍J，;1 000 IU/mL和他.:jy，i1 000 f1g/ III L的灭凶tJ!1.!盐水ill1j 10 i，i比系列稀释.分装3:IJ2夕J灭的试价11:1; 1夕。分);IJJ1II !f:盐的标111111 I:I(IL i,1 , t 2夕J分别JJII匀忱的标f!IgJ性IflLrN.将!Iji:I(IL 占怂11M11.合:11忧nlfi(2.C-8C)4h。7.3.2 1I个稀籽JJt分);1直种5枚1011龄-121-1龄(I(JXfjJl屯绒毛尿必Jl业O.2时)攸，ii:r 37C孵宵。11 !在胚，连续观察7CI. 1仪1n24 h- 168 h内死亡的内脏和168h后仍fi币的鸡!悦，观察绒毛以主运!民i止有1Mf;f吐.Jo 3 NY /1 556-2020 7.3.3 记.lK然绊，米，按半数感染t，tC Rccd-Muench)力ld十11二11)50，计贷方法见附-*Ho 7.4 结果判定911 :5H:Wlj能JIiBJ鸡IIf绒毛尿:发JI且tH Jf.典l(11.f1斑，)j日主(，:，;flJH;巾和l试验，j-IV1 ft 1 (ll .i生il平11问Itl，I(llI，J组的EII.的对数之差大fI.J(fr 2. 0 Il,t .y!II!J!II.i二分7t物为1乌传染性Ij;气岱炎病til -8 琼脂免疫扩散试验8. 1 器材8. l. 1 37.C混衍。8. l. 2 烧杯。8. l. 3 搅抖利比。8. l. 4 电磁炉。8. l. 5 单迫移浓浓(101.、100fLL、1000 11.您规格) 8. l. 6灭If;j平IlIl。8. 1.7 i显众。8.1.8 n于L?ncI心l孔.川RH于L.孔径3Illm，于LE1 mm). 8. 2试剂8.2. 1 标tflx鸟传染VI:II侠气炎病，l 1111怕1(llW。8. 2 2 标HU乌传染nllf气管炎的存IVI性1(llil.8. 2 3 标iflX鸟传染VI:I收气43炎病i.f;J.J;扣1IIItl句L原。8. 2. 4 标flX4传染性l收气价炎病J;JJ;(扩IVJ性抗l束。8. 2 5琼JJi1粉1.8.2.6 0.015 mmol!l. 11-门.2PBC见八:l)。8. 2 7生JI!J，;i:7KC见1.1)。8. 2 8 氧化俐。8. 3 试验程序8 3. 1 琼脂板和j备JIrI.附录c1 (I(J (1 8.3.2 打孔、封底拍tlil)备!J(I(.Im)i1板UJlJT-fLllHI孔，)j挑Ih孔rj的J);UH1中心1孔，川网6孔-fL1王3ml啊，孔Jji4 mm .110火焰上NJliO。8.3.3 加样8. 3. 3. 1 病原检测小心孔JJII入标fi鸡传染性l收气fT炎!Ij,: 1111性的Li斤，第l孔、第4孔JII入衍;fU!l传染刺眼气lJ炎病IlJ;E;扣阴阳抗原和析、fI鸡传染VI:II侠气价炎病/.:;ji扩IV附:抗原只i也孔分且1)J11入筒检中r，d，(见附泣。.20Id./-fL.的:5 min.IO min.将川样后的平lIIl轻轻倒应放入川平Ti纱布的众内.J吐二37DCilt辑1.分月1)在21 h18 h )H己，A结果。8.3.3.2 抗体检测rJ心孔1m人标1(1均传染性l收气炎州，:rUHJJIIWJ:抗bH.第l孔、第4千LJm入析、IfJ;X乌传染性叫声气竹炎病.ii, 111 - 1 tJ : 1(ll irl和标1(1鸡传染I:lIfR气tT炎的il IV)性Ifll沽，其他孔分川J11人待枪1(II_i，;或知1千Ljm入标rfu乌传染J:I收气岱炎州市111111 1(11 1,1 .其他孔分)I)m人fFf比稀释的1!i位Iflli,l (.hl附*C) .201./孔。将力11样后(19J);O)i1 饭j)Jc.人填平rM纱布的企内Jlt二j二:l7.C11，省J.分别在21h48 h 然jj记录结尿。8. 4 结果判定NY /1 556-2020 8.4. 1 试验成立条件小JI(U乌传染ftl收气价炎州tlt阳n，(，l扩i与1fj传染性叫声气筒炎病肖Jl(jf川IVI:HU束孔之间j吕Jsli:,i IIYi jL淀线，十，1(1鸡传染nl收气于1炎11JT:阳nl(1I泊与1Li传染性1I1iI (;炎的lJJ)(扩阴性打LJJit孔之间未形成iti11析沉淀线。8. 4. 2 结果判定8.4.2. 1 病原检测lH命样lfh孔与你叫 :x马传染nll1i气供炎病1年1111Vi1(11 ，;孔之间IllJ沉淀线，.LI与标叫传染咽喉气炎),; ilj)jji II性JJLJf，(沉淀线二k制11吻介.UIIi阶且具韭剖41l检样川L与刷l鸡传染例子叫叭13炎乐11ll1rl11: 1(11 ，子L之间无jL淀线1.1且M町UJll)jfi.i 1.iii 8. 4. 2. 2 抗体检测f仲仰附:f附附阳h检阳阳号忖忖d响l川圳鸡乌驯f嗡雏缅画眩川川1lJ.州创叨川勘驴协?晴喃哩酷酷酷(.叫叫叫叫.屿叫叫叫刀阴阳叫叫叫与圳蝴忡刷驯叩$切标仰俐圳，川叫川飞叶刑I泊i斗价附H炎病蜘刷刷j耳巧!5j问阳州阳川川|阳胜酌削阳怕性酌川阳i汁ClII的I./i沉淀主、-院d如且以蜘也!Jji暗矗传染性II直气管炎病df琼扩问|性抗)fll孔之1;1标IW:.I(传染训1111UJll1 头il.j检|9 9. 1 器材9. 1. 1 9.1.2 9. 1. 3 9. 1.4 9. 1. 5 9. 1. 6 9. 1. 7 L. IE! iit 凝胶;垃l1与心9.2 试剂.1I 9.2. 1 ICR试剂且-，9. 2. 1. 1 PC!( 耐用应9. 2. 1.2 灭Jii去7月子9.2.1.3 ;1物.ICP4-1 F, 5 .iC丁GlICP4-1 R,5CATCCGCACA 9. 2 2 电泳试剂9.2 2. 1 liij/(缓冲浪，50X丁八J:jiM(f.妃Ji见Al恼川II，J)JI;，在俑水配l戊IX TAE级/11淑配方1止A.5。9.2 2 2 Jmm粉网产成ill口的jl邸J)jOll可拙。9 2 2.3 l!)(!JI川平缓冲液配Jil)，l，A. 6。9.2.2 4 DNA Marker(fiJ，IfJ分子娃儿分子大小rliI有为l以)bp-2 000 bp。9. 3 样晶准备9.3. 1 阳性对!f!已知l州市材料，IiILTV!f染的1鸟IJL9. 3. 2 II性别!世未感染的鸡脏。9 4 试验程序9.4 1 核酸提取F d NY /1 556-2020 9 4. 1. 1 病毒DNA抽提见11f.t泣。中的D.1 0 9.4. 1.2 核酸提取等效方法可采川等放DNAJ!J取试剂和方法，M采用自动化核酸jJtJtil.仪和l配套核酸书I IJ!J试剂.ll行核阪提收。9. 4. 2 核酸扩增9. 4 2 1 11物:将引物(ICP4-IF/IR)稀释到l工作浓度10pmol/L。9. 4. 2 2 PCR反应混合液配11:1，按照PCR试开11众说191书配11，1反应体系，你个PCR铠巾J1II入各1vl.上下游引物(ICP4-IF/1R)09.4 2 3 PCR扩增在其巾一个PCR价中J1II人5Lxr)传染11:1I1气管炎病得DNA，设为阳创对I!(l;在川一个PCR价1J1II人51-_ L li ill水，作为阴性空白对!i!，在其他PCRI.分)j11J1II人51 1. f价样品。NA锁饭e荒1去住荒.放入扩增仪1饺!l设寇在Uf扩11斗950C预变性5min:然后进行:l5个循环，)4C变性:lOs、5SoC退火30s、720C延11145s，放后720C延115 min，40C似存备Hlo9. 4. 3 扩增产物电泳检测l9.4.3.1 1.0%JJ;UHi糖凝胶板的1111备见附.)REo 9. 4.3.2 Jm样月Sl6川.811. PCR扩RFl产物和2vl. J1II*(缓冲液11，匀后J1II人一个Jm样子L。如l狄rl!，泳1. 1 11扎进际叫1:DNA Markcr ，1IJHI只I!自、问l11x.1!f!。9. 4 3. 3 Il!，泳rl!，斤、80V100 V或电I/rnA50mA，11:t，泳30min.40 min。品后，1 11 ihI胶成卑系统观察)j拍照记5209. 5 试验成立条件阳性别照品H:J 689 bp jjJ曾条斗!l;，同时阴性;，j!UJl元书 .l条斗，1;(参见|时，JolF)。9. 6 结果判定钓台9.5 (IJ条件.1lj检样I111扩增产物Ilt.ilt出现689bp H标条j;，; JJ为PCRJtm 111ltt.表明样川Hr:，x38， .El无标fl扩附1111线.!fiJ为rgJ性，c) 样古j，35们!li豆38，且扩WlIlIl线均达标liI的SJBIIII线.II为百l疑.元;革新检测。nm复Jfi仍然7-J上述结果.)IJ为阳创.脊则IJjg旧l性。11 诊断结果11. 1 凡符合1.4.)I-J=I. 7. ,8. 4. 2.1、9.6或10.6 i任何-项阳创者，均诊断为鸡传染料喉气管炎。112 被检鸡l!-t然没有明显的l临床JiJ:状和病理变化，但病际检测r.r合11.1(1病jJK检训1);)11J标lI可判定为1乌传染性眼气信炎耐心感染。7 NY /1 556- 2020 A.l 生理盐水千七#内(NCIl j川去Tt.子水至1210C高J1i灭|有30mi A. 2 O. 015 lIlol/L U占fWpH )JII去向子水至1210C凶JVXI刷30A. 4 50XTAE储存液一泾11，1;氨基1炕Tris)冰乙I!l附录A(规范性附录)溶液配制(试剂要求分析纯)0. 5 mol/l.乙-.JI.iii!叫乙般(I.:m八)(11-18.0)!J1I双茶水车A. 5 1 XTAE缓冲液业用。J将50X丁AE攸5011稀料UII1。A.6 电泳加样缓j中液8 y! f/Ji?， 11 illl fY.茶水100. 0 ml. 1 000 ml. 。.25g 30. 0 ml. 70. 0 ml. NY / T 556-2020 A. 7 O. 5 11101/1, EDTA (pH 8. 0) EDTA-Na, 21-1,() 去离子水mNaOI一1J.f, pH JJII去离子水至1210C ，:j斥j(Ihl 30 111 i n,?i: r ，C冰箱备用。186. 1 g 800 111 L 8. 0 1000 mL A. 8 1 11101/1，1、rlS严HCI(pH8.0) r ris 133约e121 g 800 mL 8. 0 1000 mL 去711子水m 1-1 C1 JlfW l 1-1 )JII去离子水至12jC:jJT:Y( 30 min . ，):于，C冰箱备川。A. 9 5 01/1. NaCI N区，Cll:，ti子水)111去离子水至12IC;:j fK灭f#:,0 min，且于40C冰箱备用。:300 g 800 mL 1 000 I11L A.lO盼氯仿异戊醇(25: 24 : 1) 将1、rJS饱和l盼(11-18.0)、;，U.h、异戊即投!ff体积比25 21 1 li丘i/i匀，装入棕包版，以后JJII人。l11101/L的TrisHCI保护液，4C冰箱保(备用。A门DNA提取裂解液j mol/ L Tris I-ICl( pl-l 8.0) 0. 5 mol/ L 1二DTACpl-l8.0) 5 mol/ L NaCl :100 mL 1二It子水500时，12I C,:jli,j(jf;j 30 min，J+IIIt)JII入CTA13CW/V 1. 5% ) ，1J11热前仰，川J前在边i风橱内1m入1%(I古f乙醉(现用现配)。9 NY / T 556-2020 附录B(规范性附录)鸡胚半数感染量(E 11)50 ) )J!IJ定方法(Rccd-M IICCh法).l 定义%4JJ韦主r数!这染挝(I二11)，) jl1 il1i 山nch11;计l。.2 计算公式.3 举例10 C.1 琼脂平板的制备附录C(规范性附录)琼脂平板的制备NY IT 556-2020 利;Jj且J3;OH1视iI g .:h:tJ& 100 mL (1p飞21000 !阳阳750 俏的2页刊的图F.lPCR扩增结果F. 2. 1 DNA Marker (标lfi分子iID为DL2 0000 F. 2. 2 泳:ilil为阳性样illI泳j草2为阴性.J!惯。14 附录G(资料性附录)荧光定量PCR图示荧光定垃PCRI到不见陈IG. 10 100 75 咽d棋5。在到25 。5 10 15 20 25 30 35 扩增循环数图C鸡传染性喉气管炎病毒荧光定量PCR扩增图NY /T 556-2020 II.TV阳性对照检测样品阴性X.I照40 15