2、细菌分离培养、接种技术及生化.ppt

第三章 临床细菌学检验技术第二节 细菌分离培养与鉴定 P35 细菌在适宜的条件下方可生长繁殖，临床细菌标本只有经过细菌的分离培养鉴定和药敏试验，才能对感染性疾病作出病原学诊断和指导临床用药。故细菌的分离培养对疾病的预防与诊治有重要作用。2021/5/241一、培养基的种类和选择(一)基本条件1.合格的细菌实验室2.合格的无菌实验室3.基本设备和器具2021/5/242(二)培养基 培养基(culture medium)是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。用途：可用于细菌的分离纯化、传代和菌种保存可用于研究细菌的生理生化特性是对病原菌分离鉴定的主要环节和必不可少的手段2021/5/2431.培养基的组成成分：营养物质：水、蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、无机盐、鸡蛋和动物血清、生长因子（Vit、aa、嘌呤、嘧啶等）。2021/5/244凝固物质：最常用的为琼脂(agar)，它是从石花菜中提出来的一种半乳糖胶，100溶解，40凝固，可利用琼脂来改变培养基的物理性状(固体或半固体)，它是理想的固体培养基的赋形剂，其本身不被细菌分解利用，也无营养作用。2021/5/245抑菌剂和指示剂：不是细菌生长繁殖的必需物质，是制备细菌的选择、鉴别培养基和判断结果的需要。常用的抑菌剂有：胆盐、煌绿、亚硫酸钠、亚硒酸钠及一些染料和某些抗生素等。常用的指示剂有：酚红、中性红、甲基红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中国兰等酸碱指示剂，美兰为常用的氧化还原指示剂。2021/5/2462.培养基的分类 液体培养基：牛肉汤(牛肉浸液+1%蛋白胨 +0.5%NaCl pH7.4)半固体培养基：加0.20.5%agar 固体培养基：营养物+2%agar 按按物物理理性性状状2021/5/247基础培养基：是其他培养基的基础，如普通肉汤、普通琼脂平板、斜面、高层营养培养基：BAP、罗-琴培养基、吕氏血清斜面选择培养基：SS平板、BS平板、Mac平板等鉴别培养基：糖发酵管、MIU、KIA、TSI等特殊培养基：厌氧培养基、高渗培养基等按用途2021/5/2483.常用培养基的制备肉膏汤的制备：0.3%牛肉浸膏+1%蛋白胨+0.5%NaCl加热溶解，调pH 7.47.6，分装，121，20分钟高压灭菌冷后待用。可用于标本和细菌的增菌。普通琼脂平板、斜面、高层：肉膏汤+2%agar，加热溶解，121，20分钟高压灭菌冷至50 平皿 普通琼脂平板：分离纯培养和药敏 倾倒 试管(斜放)普通琼脂斜面：增菌、保存细菌 试管(直立)普通琼脂高层：备用 2021/5/249血琼脂平板：普通琼脂平板营养物质灭菌冷至50+5%10%脱纤维SRbc或RRbc，摇匀，倾倒无菌平皿，冷凝后即成血平板。常用于营养要求较高的细菌的分离纯培养和药敏。半固体肉汤：牛肉汤(牛肉浸膏汤)+0.2%0.5%agar加热溶化 分装高压灭菌冷却即成。常用于保存菌种和观察细菌的动力。2021/5/24104.选择适当的培养基：根据临床标本中细菌的需要，选择适当的培养基。2021/5/2411二、分离培养 （一）细菌的分离1.平板划线分离法分离纯培养 分区划线 连续划线2.斜面接种法 连续蜿蜒划线，从斜面底部至斜面顶端3.液体接种法 在试管内壁与液面交接处管壁上研磨，使细菌混于液体中。4.半固体接种法 穿刺接种法2021/5/24125.倾注平板法 取一定量的稀释标本加入无菌平皿，再加入冷至45左右的定量培养基，混匀，待凝后倒置培养。6.涂布法 把稀释定量被检菌液均匀涂布于琼脂平板表面。7.定量接种环法 把定量接种环沾取菌液均匀涂布于琼脂平板表面。2021/5/2413(二)细菌的培养方法 根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同环境条件进行培养，常用培养方法有：1.需氧培养：适用于需氧菌和兼性厌氧菌，在有氧环境下35孵育1824h。2.CO2培养：适用5%10%CO2环境才生长良好的细菌，如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、布鲁菌的首次分离培养。供给CO2的方法有：CO2培养箱、烛缸法、化学法(每升容积0.4gNaHCO3+0.35ml浓HCl)。3.厌氧培养法：适用于厌氧菌的分离培养，常用的方法有厌氧罐法、气袋法和厌氧手套箱法等。2021/5/24142021/5/2415(三)细菌的生长情况在平板上呈菌落(colony)生长，常用于细菌分离 纯培养在斜面上呈菌苔或菌落生长，可用于增菌或保 存菌种。半固体中呈迁徙生长(有动力)。可用于观察 动力和保种。在液体中呈表面生长，均匀混浊生长和沉淀生 长。可用于增菌和鉴别细菌。2021/5/2416思考题1.细菌有哪些分离培养与接种技术？2.简述细菌在不同培养基中的生长情况及实际意义？2021/5/2417三、生化反应 由于不同种类细菌的酶系统不同，故其新陈代谢过程中的合成代谢产物（毒素）与分解代谢产物（生化反应）也不一样，借此可鉴别细菌。生化反应：不同菌体内具有不同的独特酶系统，故对各底物(糖、蛋白等)的分解产物也不一样，用此方法来鉴别细菌叫生化反应。2021/5/2418（一）碳水化合物的代谢试验1.糖(醇、苷)类发酵试验 产酸(+)：丙酮酸、乳酸、甲酸等原理：细菌 糖类 产酸产气：CO2、H2 不分解：(-)由于不同细菌菌体内的酶系统不同，可分解单糖（葡萄糖）,双糖（乳糖），多糖（淀粉）和醇类（甘露醇），糖苷（水杨苷），代谢产物也不一样，可借此来鉴别细菌。酶酶2021/5/2419培养基：肉膏汤+1%待试糖+指示剂溶化调 pH7.4 分装高压灭菌冷后待用。有液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。方法：把分纯的细菌1%糖(醇、苷)类培养基，35 1824h 观察结果。产酸产气：如大肠埃希菌GS 结果 +产酸不产气：如伤寒b、痢疾b GS +-培养基不变色：如卡他莫拉菌应用：是鉴别细菌最主要和最基本的试验，特别是肠杆菌科鉴定的主要试验。2021/5/24202.氧化-发酵试验(O/F试验)原理：分解GS 氧化型细菌，如微球菌、绿脓b 细菌 分解GS 发酵型细菌，如葡萄c、肠杆菌科 不分解GS 产碱型细菌，如莫拉莫拉菌培养基：HL培养基(蛋白胨2g、NaCl 5g、GS 10g、agar 2.5g、K2HPO412H2O 0.3g、0.2%溴麝香草酚兰12ml、加蒸馏水至1000ml，调pH 7.2）碱性时为绿色，酸性时为黄色。方法：将待测菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支滴加无菌液体石蜡(高度不少于1cm)，35培养48h。有O2有O2或无O22021/5/2421结果：应用：检测细菌的代谢类型，进而鉴别细菌。如肠杆菌科细菌为发酵型，而非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌(发酵型)和微球菌(氧化型)的区别。注意事项：对营养要求高的细菌应在HL培养基中加入2%血清或0.1%的酵母浸膏。阴性者要延长培养时间34天再观察结果。指示剂不能用酒精溶解。液体石蜡2021/5/24223.-半乳糖苷酶(ONPG)试验原理：ONPG 邻-硝基酚 +-D-半乳糖试剂：0.75M ONPG溶液，为无色，若出现黄色，则 不应再用。方法：从KIA斜面上刮取菌苔，加入0.25ml无菌NS制成菌悬液，加入1滴甲苯充分振摇，使-半乳糖苷酶释放，置37水浴5分钟，加入0.25ml ONPG试剂，水浴(3537)20min3h，观察结果。结果：菌悬液呈现黄色为阳性。-半乳糖苷酶半乳糖苷酶水 解2021/5/2423应用：本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。迟缓分解乳糖的细菌(宋内志贺菌等)只有-半乳糖苷酶(胞内酶)，缺乏半乳糖苷渗透酶(胞外酶)或活性很低，故需几天才能将乳糖分解，若采用ONPG试验则可迅速(2030min)得出结果。因为ONPG与乳糖十分相似，且分子较小，它不需半乳糖苷渗透酶则可进入细胞内，而被细胞内的-半乳糖苷酶分解为半乳糖和黄色的邻-硝基酚。ONPG试验结果不一定与分解乳糖相一致，这主要取决于细菌产生的酶及其活性。若无ONPG，可采用5%的乳糖代替，同时减少蛋白胨的含量。2021/5/24244.七叶苷水解试验原理：七叶苷(esculin)+H2O 七叶素+GS 七叶素+Fe 2+(培养基中)黑色化合物培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。方法：把待测菌接种于七叶苷培养基，3537，1824h。结果：培养基变黑为阳性，不变色为阴性。应用：主要用于肠球菌(+)与其它链球菌(-)的鉴别。也可用于革兰阴性杆菌(-)和厌氧菌(+)的鉴别。细菌2021/5/24255.甲基红试验(methyl red test)原理：GS 丙酮酸乳酸、甲酸、乙酸，pH 本试验以甲基红为指示剂，因此：当pH5.4时呈黄色，为阴性 当pH4.5时呈红色，为阳性 当pH在4.55.4时呈桔红色，为弱阳性培养基：葡萄糖蛋白胨水方法：将待测菌接种于上述培养基中，35 24天，加入甲基 红指示剂，立即观察结果。应用：用于鉴别大肠埃希菌(+)和产气肠杆菌(-)，其他肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属均为阳性，而肠杆菌属和哈夫尼亚属均为阴性。产气杆菌产气杆菌2021/5/24266.V-P试验(Voges-Proskauer test)原理：细菌GS 丙酮酸 乙酰甲基甲醇+CO2 乙酰甲基甲醇 丁二酮(二乙酰)丁二酮+胍基(培养基中精氨酸中含有胍基)红色化合物培养基：葡萄糖蛋白胨水方法：将待测菌接种于上述培养基中，35 48h后，加入甲液(6%-萘酚酒精溶液)和乙液(40%KOH)，振摇。结果：在数分钟内出现红色者为阳性，若无红色出现且置于35 4h后仍如故者为阴性。应用：本试验与甲基红试验往往同时使用，一般前者为阳性，后者为阴性。脱羧-2HKOH2021/5/2427(二)蛋白质和氨基酸的代谢试验1.明胶液化试验：原理：某些细菌 半固体明胶 氨基酸 变成流动的液体。方法：待测菌穿刺接种于明胶培养基，22 7天，观察结果。35中明胶自动液化，若在35培养，观察前先置于4中30分钟后，再看结果。结果：培养基呈液化状态为阳性。应用：肠杆菌科细菌的鉴别。Eg：沙雷菌，普通变形杆菌，奇异变形杆菌，阴沟杆菌；某些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌；多数假单胞菌也能液化明胶。明胶酶(胞外酶)分解2021/5/24282.吲哚试验(Indole Test)原理：色氨酸 吲哚+丙酮酸 吲哚+吲哚试剂(对二甲氨基苯甲醛)玫瑰吲哚培养基：蛋白胨水方法：将待测菌接种于上述培养基中，35 2448h，加入吲哚试剂，观察结果结果：于两者液面交界处出现红色为阳性，不变色为阴性。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴别，如大肠埃希菌为(+)，产气肠杆菌(-)。色氨酸酶某些细菌某些细菌2021/5/24293.硫化氢试验原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸产生H2S，当它与培养基中的Fe2+或铅离子相遇时，则形成黑褐色的FeS或PbS沉淀。此试验可间接用于检测是否产生H2S。培养基：醋酸铁(铅)培养基。方法：将待测菌接种于醋酸铁(铅)培养基中，35培养12天，观察结果。结果：培养基变黑为阳性，不变色为阴性。应用：主要用于肠杆菌科中细菌属和种的鉴别。沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属，绝大多数为阳性，其他菌属为阴性。2021/5/24304.尿素分解试验原理：某些细菌具有尿素酶，使尿素分解产生大量氨，使培养基呈碱性(酚红为指示剂)，培养基变红。培养基：尿素培养基方法：将待测菌接种于上述培养基中，35培养1824h，观察结果。结果：培养基变红为阳性，不变色为阴性。应用：主要用于变形杆菌属的鉴定，另外雷氏普罗威登菌和莫根菌也为阳性。2021/5/24315.苯丙氨酸脱氨酶试验原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，加入FeCl3试剂后呈绿色反应。培养基：苯丙氨酸琼脂培养基方法：将待测菌接种于上述斜面培养基中，35培养1824h，滴加3滴FeCl3试剂，自上流下，立即观察结果。若延长时间观察会引起褪色。结果：出现绿色为阳性。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌、摩根摩根菌为阳性。2021/5/24326.氨基酸脱羧酶试验原理：氨基酸 胺+CO2，胺使培养基变 碱，指示剂则变色。培养基：氨基酸脱羧酶和氨基酸对照培养基。方法：将待测菌接种于上述培养基中，35 14 天，观察结果。结果：对照管呈黄色，测定管呈紫色(溴甲酚紫为指示剂)为阳性，若测定管也为黄色则为阴性。若对照管呈紫色则试验毫无价值。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，均阳性。志贺菌中除宋内和鲍氏外，均阴性特异脱羧酶特异脱羧酶2021/5/2433赖氨酸 尸胺鸟氨酸 腐胺精氨酸 精胺2021/5/2434(三)碳源和氮源利用试验1.枸橼酸盐利用试验(citrate test)原理：某些细菌能分解枸橼酸盐(获得碳源)，使培养基变碱(原pH6.8pH)，培养基(溴麝香草酚兰 为指示剂)由淡绿变为深蓝色。培养基：枸橼酸盐斜面培养基方法：将待测菌接种于上述培养基中，35 14天，观察结果。结果：由淡绿变为深蓝色为阳性，不变色为阴性。应用：用于肠杆菌科中菌与属的鉴定。如沙门菌属、克雷伯菌属一般为阳性，其他菌属一般为阴性。2021/5/24352.丙二酸盐利用试验原理：某些细菌能将丙二酸盐分解成碳酸钠，使培养基变碱(原pH6.8pH)，培养基(溴麝香草酚兰为指示剂)由淡绿变为深蓝色。培养基：丙二酸盐培养基方法：将待测菌接种于上述培养基中，35 12 天，观察结果。结果：培养基由淡绿变为深蓝色为阳性(指示剂同上)，不变色为阴性。应用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。克雷伯菌属，亚利桑那菌为阳性。2021/5/2436IMViC试验*：是鉴别细菌常用的一组生化试验。I M V C如：大肠埃希菌 +-产气肠杆菌 -+2021/5/2437（四）各种酶类试验1.氧化酶试验(kovac test)原理：还原型细胞色素C 氧化型细胞色素C 四甲基对苯二胺 有色的醌类化合物方法：滤纸法：取洁净滤纸一小块，沾菌少许，滴加试剂。试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸片上。菌落法：直接滴加试剂于被检菌落上。结果：10秒钟内呈深紫色为阳性。同时应以铜绿假单胞菌(+)与大肠埃希菌(-)做对照。应用：主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别（发酵菌与非发酵菌鉴别），另外奈瑟菌属和莫拉菌属也呈阳性反应。细菌氧化酶细菌氧化酶氧化型细胞色素氧化型细胞色素C2021/5/24382.触酶试验(H2O2酶试验)原理：具有触酶的细菌，能催化H2O2生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。即：H2O2 H20+O2(出现气泡)试剂：3%过氧化氢溶液方法：玻片法和试管法结果：产生气泡为阳性，不产生气泡为阴性应用：常用于G+C的初步鉴定，如葡萄球菌(+)，而链球菌为(-)。触酶触酶2021/5/24393.硝酸盐还原试验(nitrate reductive test)原理：硝酸盐 亚硝酸盐+氨 亚硝酸盐+试剂 颜色反应(红色)培养基：硝酸盐培养基试剂：甲液(对氨基苯磺酸溶液)；乙液(萘胺醋酸溶液)方法：将待测菌接种于硝酸盐培养基中，35 14天，加入0.1ml甲、乙等量混合液，摇匀，立即观察结果。结果：呈红色为阳性，若加入试剂后无颜色反应可能为：硝酸盐没有被还原，试验为阴性。若再加入少许锌粉，呈红色者则表明试验确为阴性，若仍不产生红色者为假阴性(锌亚硝酸红色芳基肼)应用：如肠杆菌科细菌均为阳性;铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌可产生氮(放入一倒管检测);而韦荣球菌也为阳性。还原酶还原酶某些细菌2021/5/24404.DNA酶试验原理：DNA 寡核苷酸链 溶于盐酸 菌落 周围形成透明环 培养基：0.2%DNA琼脂平板方法：把被检菌点种于上述平板，35 1824h，加入1N HCl 观察结果，同时设阳性和阴性对照。结果：菌落周围有透明环为(+)菌落周围无透明环为(-)用途：可用于鉴别细菌：球菌中：金葡菌（+）；杆菌中：沙雷菌（+）和变形杆菌（+）。DNA酶酶2021/5/24415.凝固酶试验(coagulase test)原理：致病性葡萄球菌 凝固酶 血浆中纤维蛋白原(液态)纤维蛋白(固态)血浆凝固方法：玻片法：检测结合凝固酶(生理盐水对照)试管法：检测游离凝固酶（标准菌株对照）应用：作为鉴别葡萄球菌致病性的重要指标。金葡(+)102021/5/24426.胆汁溶菌试验原理：胆汁或胆盐能促使自溶酶的活化，从而加速肺炎链球菌的 溶解。试剂：10%的去氧胆酸钠或纯牛胆汁。方法：平板法：平板菌落加一环10%的去氧胆酸钠 35 30分钟，菌落消失，为阳性。试管法：试管中菌液0.9ml+10%去氧胆酸钠0.1ml 35水浴1030分钟，观察结果，变清亮为(+)，仍混浊为(-)。同时用NS设阴性对照(混浊)。应用：主要用于链球菌(-)和肺炎链球菌(+)的鉴别。2021/5/24432021/5/2444思考题：1.简述细菌合成代谢产物检测的内容、原理、方法、结果和临床价值。2.简述细菌常用分解代谢产物（生化反应）的原理、方法、结果及临床应用。2021/5/2445