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Western blotting Protocol
操作步骤
一、提蛋白
1、对数生长期细胞经过不同浓度的药物处理（如上图）。
2、配制蛋白裂解液：RAPI(199µl)+PMSF(1µl)；
3、用胰酶消化细胞，加入EP管中，冷PBS清洗3次，每次3000rmp、4℃、离心10 min；
4、向EP管中加入100µl （RAPI+PMSF），冰上裂解30 min，14000rmp、4℃、离心10 min；
5、取上清液，-80℃保存。

三、Western blot前期准备工作
配制TBST、5x电泳液、5x电转液
1、5x电泳液配制
15.1g Tris 用尽量少的水溶解后定容到1L，得到5x电泳液
94g 甘氨酸
5g SDS
跑胶时使用1x电泳液，需要800ml
2、5x电转液配制
15.1g Tris 分别溶解后二者混合，定容到1L，得到5x电转液

75.1g 甘氨酸

使用时将电转液配制为1X=电转液（5X）:甲醇：双蒸水=1:1:3；

准备1ml、200µl、100µl、10µl枪及枪头，1个小烧杯，固定好两层玻璃板；
1、配制8%分离胶（5ml）
ddH2O 2ml
30%Acr-Bis(29:1) 1.35ml
1M Tris PH 8.8 1.25 ml
10%SDS 75µl
甘油 200µl
10%AP（过硫氨酸）500µl
TEMED 3.5µl

2、配制5%积层胶，共2ml
ddH2O 1.7ml
30%Acr-Bis(29:1) 412.5µl
1M Tris PH 6.8 312.5 ml
10%SDS 25µl
10%AP（过硫氨酸） 25µl
TEMED 2.5µl

3、解冻5xSDS上样缓冲液（吸面上的），蛋白加入PCR反应管中，分别加入5µl 5xSDS上样缓冲液+20µl蛋白（使5xSDS上样缓冲液变为1xSDS上样缓冲液，且每次加入蛋白浓度都不一样）。
4、将PCR反应管用封口膜封口后，放入沸水中煮5min，冰浴5min。
5、将玻璃板放入电泳槽中，倒入1x电泳液（检查是否漏水），取下梳子。

三、做Western blot

配好后，将该凝胶溶液缓慢注入两层玻璃板中，倒入距边缘1cm时即可，用饱和正丁醇压线，室温静置30min，倒掉上面正丁醇，用滤纸吸干

配好后将积层胶快速注入两玻璃板内，插上1cm梳子，静置30 min

6、上样。
7、跑胶：积层胶80V、20W、30mA，15min（当蓝色条带跑至分离胶时换电压）
分离胶120V、20W、30mA，当Mark35条带跑没有时停止电压。
8、转膜：①将滤纸用1x电转液浸泡。（5x电转液20ml：甲醇20ml：双蒸水60ml=1:1:3），将PVDF膜用纯甲醇浸泡》10min，后放入1x电转液浸泡；
②结束电泳后，桌上铺保鲜袋；
③在电转器上铺上浸泡后的滤纸+PVDF膜+胶+滤纸。（注：在放置过程中，每放一样均用玻璃赶走气泡，并于膜的右上角剪缺口，便于分清正反两面，PVDF膜要与胶等大）
④25 V、35min进行电转后取出PVDF膜。
9、配制TBST=TBS:吐温20=500ml:500µl=1000:1(取吐温时，在枪头剪一斜口，便于吸液)；
10、洗膜：将TBST置入弯盘内，清洗PVDF膜，洗三次，每次10min。
11、封闭：5%脱脂牛奶（0.2g脱脂奶粉+4mlTBST，用漏斗配制），将膜放入手套内，打入封闭液，封闭液的量=长x宽x0.2，室温摇床1h。
11、用TBST洗膜3次，每次10min。
12、一抗封闭及洗涤
一抗稀释：一抗(ppar-gamma)1µl+一抗稀释液1ml=1:1000，袋中加入1ml稀释好的一抗，摇床60min后4℃过夜。
13、取出PVDF膜：TBST洗3次，每次10min。
14、加入二抗：荧光二抗1µl+二抗稀释液10ml=1:10000，袋中加入1ml稀释好的二抗，摇床60min，注意避光操作。
15、曝光。

BCA蛋白浓度测定：
1、根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
2、 完全溶解蛋白标准品，取10µl稀释至100µl，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。
3、 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20µl加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20µl。
4、 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20µl。
5、各孔加入200µl BCA工作液，37℃放置30分钟。
注: 也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。
6、 测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。