科研英文文献汇报英文ppt--MicroRNA复习课程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,科研英文文献汇报英文ppt-MicroRNA,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,Results,Conclusion,Methods,在全世界，肺癌是癌症相关性疾病中主要的致病因。尽管手术及药物治疗水平有所提高，肺癌患者的生存率依然极低。总体来说，分期较早的非小细胞肺癌患者，无论是手术还是非手术患者均得到了控制。然而，非小细胞肺癌导致局部及远处转移的分子机制尚不清楚。,在非小细胞肺癌组织中，我们证实了,microRNA-224(miR-224),显著上调，尤其发生转移的组织中。增加,miR-224,表达水平，其通过以抑癌物质,TNF-induced protein 1(TNFAIP1),（肿瘤坏死因子介导蛋白,1,）及,SMAD4,为靶点，从而促进了细胞的迁移，侵袭及增殖。与体外实验一致，裸鼠异体移植实验也证实了,miR-224,在体内非小细胞肺癌中作为强力致癌的,miRNA,。同时，我们还发现了在非小细胞肺癌中，启动子甲基化及,ERK,信号参与调节,miR-224,的表达。上调的,miR-224,通过拮抗,SMAD4,及,SMAD4,的抑制作用，从而增强非小细胞肺癌的形成及肿瘤侵袭性。,全基因组,miRNA,测序,miR-224,在,ADC,及,SCC,中,miR-224,明显上调,体内,体外,相关分析,细胞转染,过表达及下调系统,细胞系,裸鼠,miR-224,在肺癌中的作用,寻找,作用靶点,TNFAIP1,及,SMAD4,的,3-UTRs,共转染,3-UTRs,及,miRNA,转染细胞,相关分析,TNFAIP1,及,SMAD4,是否为特异性靶点,TNFAIP1,及,SMAD4,与,miR-224,相关性及作用,miR-224,以,TNFAIP1,及,SMAD4,的,3,端为作用靶点,低甲基化探针,相关分析,miR-224,与启动子甲基化的关系,相关分析及细胞系,佛脂醇治疗,启动子低甲基化及激活的,ERK,信号通路介导,miR-224,的表达,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,Results,Conclusion,Methods,非小细胞肺癌,NSCLC,（,nonsmall cell Lung cancer,）,非小细胞型肺癌包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的,80%,，约,75%,的患者发现时已处于中晚期，,5,年生存率很低。,MicroRNAs,（,miRNAs,）,是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码,RNA,，其大小长约,2025,个核苷酸通过碱基互补配对的方式识别靶,mRNA,，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶,mRNA,或者阻遏靶,mRNA,的翻译，参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、器官形成、细胞增殖和凋亡等。,TNFAIP1,（,TNF-induced protein1,）,肿瘤坏死因子-,（,Tumor Necrosis Factor,，简写,TNF,）是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子,。而肿瘤坏死因子介导蛋白,1,涉及,DNA,合成及凋亡,.,SMAD4,Smads,家族蛋白在将,TGF-(,转化生长因子,),信号从,细胞表面受体,传导至细胞核的过程中起到关键性作用,。,按功能分为,3,类：即受体活化型或通路限制性,Smad(R,Smads),、,共同通路型,Smad(Co,Smad),和抑制性,Smad(I,Smads),。,Results,miR-224,上调在非小细胞肺癌中的功能,全基因组,miRNA,测序,倍数变化的,miRNA,miR-224,技术路线,俄亥俄州立大学,综合癌症中心,癌症和肿瘤基因图谱,miR-224,在,ADC,及,SCC,中的表达,原位分子杂交,在有转移的肺癌中,miR-224,的表达,生存分析,miR-224,与肺癌患者的预后,肺癌中,miR-224,的表达水平及是否与转移有关,转染细胞,统计细胞的迁移、侵袭及增殖能力,过表达及降低系统,miR-224,在肺癌中的作用,体外,转染细胞,皮下注射至裸鼠,过表达及降低系统,miR-224,在肺癌中的作用,观察肿瘤体积及镜下改变,体内,4,例伴淋巴结转移的肺腺癌,6,例不伴淋巴结转移的肺腺癌,genome-wide miRNA sequencing,87,例,NSCLC,48,例,NAT,(,正常,),在,ADC,及,SCC,中，,miR-224,明显,上调,Ohio State University Comprehensive Cancer Center(OSUCCC),俄亥俄州立大学综合癌症中心,666,例,ADC,及,SCC,86,例,NAT,相较于,NATs,，,miR-224,在,ADC,及,SCC,中明显,上调,Of the evaluable 468 primary lung ADC patients,46 patients had matched normal adjacent tissues.Of the evaluable 198 primary lung squamous carcinoma patients,40 patients had matched normal adjacent tissues.,The Cancer Genome Atlas(TCGA),癌症和肿瘤基因图谱,明确分期,281,例,ADC N0,143,例,ADC N1+,伴淋巴结转移的患者中，,miR-224,明显,上调,miR-224 expression in 281 N0 patients versus 143 N1+patients from TCGA lung ADC dataset,NSCLC,NATs,miR-224,在,61%,的病例中,过表达,51,例,配对,原位分子杂交,在有转移的肺癌中，,miR-224,表达更强,miR-224,可能在有转移的肺癌中起到重要作用,Summary of tissue micro array data for lung cancer and corresponding normal tissue.Paired analysis represents subtraction of NAT staining score from matched lung cancer tissue scores.,miR-224,表达与生存之间,并无,明显联系,642,例,NSCLC,KaplanMeier,生存分析,TCGA,miR-224,与有,(kras)/p53,突变肺腺癌患者的不良预后,明显相关,59,例,ADC,KaplanMeier,生存分析,同样地在有,(kras)/p53,突变肺腺癌患者中，相较,N0,组，可观察到,N1+,组,的,miR-224 expression,表达上调，,miR-224 expression in 31 N0 patients versus 26 N1+patients from lung ADC patients who have TP53 and/or KRAS mutations.,H 1299,H 1573,H 460,miR-224,过表达,转染含,miR-224,前体的,Lenti-miR,载体,A 549,miR-224,下调,转染含,miRZip-224 antimiR-224,结构的载体,RT-PCR,H1299,H1573,miR-224,过表达,H1299 and H1573,细胞的迁移，侵袭及增殖,明显增加,Cell,migration,assay for miR-224overexpressing H1299 andH1573 cells using transwell membranes,Cell invasion assay,for miR-224,overexpressing H1299 and H1573 cells,Cell,proliferation,assay for miR-224overexpressing,lung cancer cells,迁移细胞计数,H460,Migrated cell counts,after,overexpressing,miR-224,in H460,Migrated cell counts after,knockdown,miR-224 in A549 cells,Migrated cell counts after,overexpressing,miR-224 in H1299(e),H1573(f),H1299,及,H1573,A549,migration assay for miR-224,knockdown A549 cells,Cell proliferation assay for miR-224 knockdown A549 cells,Migrated cell counts after knockdown miR-224 in A549 cells.,H460/miR-224,对照组细胞系,或,A549/miRZip224,皮下注射至裸鼠侧面,相较于对照组细胞，,过表达,miR-224,的,H460,细胞系,显著增加了体内的肿瘤增长,下调,A549,细胞中的,miR-224,皮下注射至裸鼠侧面,肿瘤体积减少,在肺癌中,miR-224,作为致癌,miRNA,.,镜下,Results,miR-224,以,TNFAIP1,及,SMAD4,的,3,端为靶点,技术路线,生物信息分析,TNFAIP1,及,SMAD4,的,3-UTRs,寻找靶点,共转染,3-UTRs,及,miRNA,是否为靶点,免疫荧光,共转染突变,3-UTRs,及,miRNA,靶点特异性,免疫荧光,TNFAIP1,及,SMAD4,是否为特异性靶点,过表达及降低系统,miR-224,对靶蛋白的影响,OSU,TCGA,数据库,检测,TNFAIP1,及,SMAD4,表达,相关分析,TNFAIP1,及,SMAD4,与,miR-224,相关性,转染细胞,miR-224,的促癌作用是否由于与靶基因,TNFAIP1,及,SMAD4,结合并降低抑癌作用,过表达及降低系统,转染,SMAD4,至过表达,miR-224,细胞,评估,SMAD4,作用,TGF-,治疗,miR-224,是否通过以,SMAD4,为靶点而影响,TGF-,信号通路,3-UTRs,的荧光信号持续性减低,3-UTRs,miR-224 mimics,293T,cells,共转染,miR-224,3-UTRs,的突变形式,野生型,3-UTRs,的荧光信号持续性减低的,趋势减弱,野生型的及,突变的,TNFAIP1 and SMAD4 3-UTRs,与,with miR-224 mimic,共转染至,293T,细胞,miRNA and 3-UTRs,靶点的特异性,.,在,H1299,H1573,和,H460,细胞系中，,mRNA and,蛋白质的,TNFAIP1 and SMAD4,表达,减少,过表达,miR-224,Western blot and quantitative RT-PCR,检测转染了表达,miR-224,前体的及对照载体的肺癌胞中，,TNFAIP1,及,SMAD4,蛋白及,mRNA,水平,在,A549,细胞中，,TNFAIP1,及,SMAD4 mRNA,蛋白质水平表达增加,下调,miR-224,Western blot and quantitative RT-PCR,检测转染了表达,下调,miR-224,的及对照载体的肺癌胞中，,TNFAIP1,及,SMAD4,蛋白及,mRNA,水平,检测,miR-224,对,靶蛋白及靶,mRNA,的影响,TNFAIP1(P=4.9E-15)and SMAD4,(P=2.2E-16),表达显著降低,TNFAIP1,和,SMAD4,表达降低原发性肺鳞癌组织,TNFAIP1,和,SMAD4,减少,.,334ADC&57NATs,349SSC&51NATs,TCGA dataset,NSCLC,中,TNFAIP1(5.23E-14)and SMAD4(2.67E-06),的表达下降,TNFAIP1 and SMAD4 expressions in 63 NSCLC patients with 48 matched NATs from OSU cohort,63,例,NSCLC,&48 NATs,111,例,NSCLC OSU,306,例,NSCLC TGGA,Pearson,相关分析,miR-224,与,TNFAIP1 and SMAD4,呈负相关,OSU cohort,TCGA,TNFAIP1,下调,增加,H460,的迁移及增值能力,knockdown H460 cells using transwell membranes,migration assay for TNFAIP1,for TNFAIP1 knockdown H460 lung cancer cells,.,Cell proliferation assay,Western blot analyses,cell migration assay,TNFAIP1,下调,增加,H1299,的迁移及增值能力,Cell proliferation assay for TNFAIP1 knockdown H1299 lung cancer cells,Cell migration assay for TNFAIP1 knockdown H1299 cells using transwell membranes,在用,TNF,治疗后，相较,H1299/miRCont,细胞，,H1299/miR-224,细胞,中,poly(ADP-ribose)polymerase 1(PARP1),表达水平减少,Western blot analysis,H1299/miR-224 and H1299/miRCont cells,用及不用,TNF,处理,4 h,Cell proliferation assay for H1299/miR-224 and H1299/miRCont cells,用及不用,TNF,处理,4 h,.,在,H1299,细胞中，,miR-224,明显减缓,TNF,介导的生长抑制,miR-224,通过以,肺癌中的,TNFAIP1,为靶点参与,TNF,介导的凋亡,稳定过表达,miR-224,的肺癌细胞中转染,SMAD4,H1299 and H1573,肺癌细胞中均减弱了介导的增加增殖及迁移的能力,proliferation assay and migration assay of miR-224overexpressing cells transfected with SMAD4 or empty vector,Western blot analysis of miR-224 overexpressing cells transfected with SMAD4(do not contain 3UTR)or empty vector,cell migration assay for miR-224 overexpressing cells transfected with SMAD4 or empty vector,用,TGF-,处理,miR-224,过表达组及对照组细胞,在,H460,细胞中，,miR-224,明显损害了,TGF-,介导的,SMAD4,细胞核转录作用,miR-224,明显减弱了,TGF-,介导的对细胞生长及迁移能力的抑制作用,miR-224,以,SMAD4,为靶点在,TGF-,信号通路中起到重要作用,Results,启动子低甲基化及激活的,ERK,信号通路介导,miR-224,的表达,技术路线,低甲基化探针,检测,miR-224,启动子甲基化水平,miR-224,与启动子甲基化的关系,甲基化特异高分标率溶解分析,重硫酸盐序列,验证,TCGA,数据库,相关分析,TCGA,数据库,检测,ERK,及,miR-224,表达是否相关,相关分析,细胞系,佛脂醇治疗,免疫荧光等检测,miR-224,是否受,ERK,信号通路调控,miR-224,miR-452,及,GABRE,的标准化表达值从,TCGA,数据库中提取出并进行,Pearson,相关分析,miRNA,表达受表观遗传修饰及转录激活控制。,miR-224 and miR-452,位于宿主基因,-Aminobutyric Acid A Receptor(GABRE),内显子,5,上，并且,GABRE,启动子,区域有,CpG,岛,图式结构,显示,miR224miR452GABRE,的基因位点。,miR-224 and miR452,位于,GABRE,的,6,内显子,.TSS i,显示假定的转录位点。黑色区域显示,CpG,岛延伸到,GABRE,的外显子,1,正相关,这三个基因受相同的启动子调节,选择位于,CpG,岛位于启动子区域的,9,个甲基化探针,Pearson,相关分析,ADC(n=221),SCC(n=125),8,个探针均显示在,NSCLC,中与,miR-224,表达的负相关,miR-224 and methylation probe cg27049053 in(A)lung ADC and(B)SCC,.,启动子甲基化在抑制,miR-224,转录中起重要作用,甲基化特异高分标率溶解分析,469NAT 489NAT,A549,H647,469NAT,及,485NAT,细胞,1030%,甲基化,，两个肺癌细胞系中,0%,甲基化,melting curves,from each cell line-green,standard melting,curves-orange,重硫酸盐序列,469NAT 489NAT,证实了正常肺组织中每个,CpG,甲基化水平,用脱甲基化试剂,5-aza-CdR,处理,3,天,miR-224,表达水平增加,非小细胞肺癌中，,miR-224,启动子相关,CpG,岛的低甲基化水平的部分原因是由于肺癌中的,miR-224,高表达。,前期研究,我们观察到一个趋势：相较野生型的肺癌细胞系，有,RAS,突变的肺癌细胞系中,miR-224,的表达更高。,188,例,ADC,总,ERK2,蛋白与,miR-224,表达水平之间存在显著正相关,用佛脂醇活化,ERK1/2,H460,A549,相较不使用佛化醇治疗的肺癌细胞系，使用佛脂醇的细胞系中,miR-224,的表达均明显上调,A549,H460,用佛脂醇活化,ERK1/2,H460,A549,包含,miR-224,启动区域的荧光素酶显著增加了荧光素酶活性，在,PMA,治疗后更加,明显,miR-224,可能被,ERK,信号通路调控,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,目录,Contents,intr,oduction,Others,Methods,Results,Discussion,Discussion,大多数的人类恶性肿瘤均与异常表达的,miRNA,有关，有一部分,miRNA,作为致癌因子，另一部分作为抑癌因子。大多数报道指出，包括肝细胞癌，结直肠癌，乳腺癌等在内的实体瘤均与,miR-224,的上调有关,最近有研究显示，,miR-224,在非小细胞肺癌中具有致癌的生物学价值。,KaplanMeier,生存分析显示,miR-224,表达与非小细胞肺癌生存率并无显著联系，可能由于分期不同，接受治疗不同。,亚组分析指出,miR-224,与有,kras/p53,基因突变的,ADC,患者预后差有关,miR-224,作为致癌的,miRNA,，通过以,TNFAIP1 and SMAD4,为靶点促进癌细胞的迁徙，增殖及侵袭,TNFAIP1,在,ADC,及,SCC,中明显下调，并且，,miR-224,与非小细胞肺癌中的,TNFAIP1,水平呈明显负相关。,miR-224,通过以,TNFAIP1,为靶点，减弱了由,TNF,介导的细胞生长抑制作用。,Discussion,SMAD4,的缺失对,TGF-,的信号活化起到重要作用，非小细胞肺癌的异常的,SMAD4,表达机制尚未明确。在非小细胞肺癌中，,SMAD4,的缺失可能归因于,miR-224,的异常表达。我们观察到，与正常组织相比，非小细胞肺癌中的,SMAD4,呈现出下调，并且与,miR-224,呈明显负相关。肺癌细胞中，过表达的,SMAD4,明显减弱了,miR-224,介导的增殖和迁徙，且,miR-224,通过抑制细胞核内的,SMAD4,转录从而参与,TGF-,信号通路。,综上，我们实验指出,miR-224,介导,的,TNFAIP1,及,SMAD4,减少是由于非小细,胞肺癌的侵袭和过程。,Discussion,miR-224,的启动子区域有,CpG,岛，我们假设,miR-224,的表达可能涉及启动子甲基化。为了验证，我们采用了,MS-HRM,分析及重硫酸盐序列方法，在正常肺组织中发现了甲基化，而在两个肺癌细胞系中并未发现。探针,cg27049053,在肺鳞癌及肺腺癌中的甲基化与,miR-224,呈明显负相关。此外，用,5-aza-CdR,治疗后的肺非正常组织显著修复了,miR-224,表达。,miR-224,的上调表达可能是由于,miR-224,启动子的甲基化,Discussion,KRAS,基因在肺鳞癌中很常见，为验证,ERK,信号通路的活化状态是否与,miR-224,的表达增加有关，我们通过萤光素酶报告发现由,miR-224,启动子载体诱发的活化,ERK,信号通路的荧光信号增强。而敲除,c-Jun,显著减少了,miR-224,启动子载体的荧光信号。同样地，由,PMA,活化的,ERK,信号增加了,miR-224,的表达。在敲除,c-Jun,肺癌细胞中也观察到了,miR-224,表达减少。,综上，我们实验指出,c-Jun,可能粘附于,miR-224,的启动子区域，继而调节肺癌细胞中的,miR-224,表达。,E2F1,及,c-Jun,之间的相互作用可能导致了,GABRE/miR-224,的转录，继而调节侵袭和转移。,Discussion,为了探索,ERK,信号通路及,miR-224,启动子甲基化之间的关系，我们正常肺组织来源的细胞,PMA,，并评估,miR-224,启动子的甲基化水平，然而实验未发现变化，故猜测二者可能相互独立。,在体内试验中，相较对照组，裸鼠注射了,miR-224,过表达及下调细胞系出现了相对应肿瘤大小的增大及减小。体内实验支持体外实验的结果,-miR-224,在非小细胞肺癌中作为致癌基因。,Discussion,我们的实验指出，在肺癌中，启动子甲基化及,ERK,信号活化参与调节,miR-224,表达。并且进一步显示了,miR-224,通过以,TNFAIP1,及,SMAD4,为靶点调节细胞迁移，侵袭及增殖的重要功能。显现出了以,miR-224,为靶点而治疗肺癌的可观前景。,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,目录,Contents,intr,oduction,Others,Methods,Results,Discussion,Relative knowledges,Questions,Thank you!,From Ting Li,在用佛脂醇治疗的细胞中，,pERK,及,c-Jun,蛋白水平增加,用,PROMO 3.0,转录因子粘贴位点预测服务分析,miR-224,的启动子区域,C-Jun,C-Fos,包含,miR-224,启动区域的荧光素酶显著增加了荧光素酶活性，在,PMA,治疗后更加,明显,萤光素酶报告基因显示：包含,miR-224,启动子及对照组的载体及,si-Cjun,共转染至,293T cells.,下调,c-Jun,导致肺癌细胞中,miR-224,的表达,此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢,