生活饮用水微生物指标检验.ppt

生活饮用水微生物指标检验2023/5/242023/5/241 1检测依据：GB 5750-2006生活饮用水卫生检验规范2023/5/242023/5/242 2实验目的与要求掌握水样采集规则及注意事项。熟悉常用水卫生细菌学指标。熟悉菌落总数、大肠菌群、耐热大肠菌群的测定方法及检测意义。学会对所检测的水样作综合分析。2023/5/242023/5/243 3生活饮用水中微生物指标项目单位限值说明总大肠菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得检出一般性污染耐热大肠菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得检出指示粪便污染大肠埃希氏菌MPN/100mL或CFU/100mL不得检出指示粪便污染菌落总数CFU/mL100一般性污染贾第鞭毛虫个/10 L1肠道原虫隐孢子虫个/10 L1肠道原虫2023/5/242023/5/244 4水微生物检测的意义水体的微生物污染问题日趋严重。在各种水体，特别是污染水体中存在有大量的有机物质，适于各种微生物的生长。水体中微生物污染的来源：土壤，以及人类、动物的排泄物污染。水体中少数致病微生物（主要来自人或动物的粪便污染）可导致某些肠道传染病传播。水微生物检测可用于评价水质情况，预报水质的污染趋势，以保证水质的卫生安全。2023/5/242023/5/245 5在实际工作中，对水质卫生质量的评价和控制，是无法对水体中各种可能存在的致病微生物一一进行检测。一般选择有代表性的一种或一类微生物作为指示菌，通过对指示菌的检测，来了解水体是否受到过的微生物污染，是否有肠道病原微生物存在的可能。2023/5/242023/5/246 6水微生物的检测指标菌落总数(aerobic bacterial count)是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37经48h培养后，所生长的细菌菌落的总数。检测意义：作为一般性污染的指标，即评价被检样品的微生物污染程度和安全性。水样菌落总数越多，说明水被微生物污染程度越严重，病原微生物存在的可能性越大，但不能说明污染的来源。2023/5/242023/5/247 7水质微生物的检测指标总大肠菌群(coliform bacteria)是指一群需氧及兼性厌氧的，37生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。检测意义：作为粪便污染的指标。水样总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。2023/5/242023/5/248 8耐热大肠菌群耐热大肠菌群（thermotoletant Coliform Organisms）：在4444.5下具有与大肠菌群相同发酵及生物化学性能的菌群。注意：我国习惯上把耐热大肠菌群称为“粪大肠菌群”。2023/5/242023/5/249 92023/5/242023/5/241010实验内容水样采集；菌落总数的测定；总大肠菌群的测定;耐热大肠菌群的测定。2023/5/242023/5/241111微生物指标常规检验流程水样水样总大肠菌群总大肠菌群菌落总数菌落总数报告报告报告报告耐热大肠菌群耐热大肠菌群或大肠埃希氏菌或大肠埃希氏菌报告报告2023/5/242023/5/241212一、水样采集2023/5/242023/5/241313水样采集采样原则所采集的样品具有代表性。采样容器：选择无菌硼硅玻璃瓶和聚乙烯塑料瓶。不能是新的污染源；不吸收或吸附某些待测组分；不与待测组分发生反应。保证从采样到分析期间，样品各组分的浓度不发生改变。微生物样品必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证在运送、贮存过程中不受污染。2023/5/242023/5/241414水样采集自来水水样：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5 min（经常用水的水龙头放水13min）后，采集水样于无菌玻璃瓶，约占瓶容量80%，以便摇匀水样。水源水水样：选有代表性的地点及可疑地方，一般距水面下1015cm采样。采样后，将瓶塞盖好，再从水中取出。2023/5/242023/5/241515水样采集注意事项严格无菌操作。做好标记：采得水样后应立即记录水样名称、地点、时间等内容。从速送检。水样从采集到检验不应超过2h，在4下保存不应超过24h。2023/5/242023/5/241616实验前准备1、灭菌吸管 10mL、1mL刻度吸管分别包好，160干烤2h灭菌2、9mL灭菌生理盐水3、相应的灭菌培养基4、检验前，无菌室及超净台用紫外线灯照射30min2023/5/242023/5/241717菌落总数定义：是指水样在营养琼脂上有氧条件下37培养48h后，所得1mL水样所含细菌菌落的总数。培养基：营养琼脂 设备：放大镜/菌落计数器2023/5/242023/5/241818菌落总数平板计数法2023/5/242023/5/241919菌落总数平板计数法方法水样摇匀20次左右，使细菌分散。倾注培养：无菌吸取1ml水样分别置于2个空平皿，另一个作空白对照。再倾注15ml琼脂（约45）于平皿中旋转，混匀待琼脂凝固后倒置3748h。菌落计数：用肉眼或放大镜检查，计数平皿内菌落数目。2023/5/242023/5/242020菌落总数平板计数法结果分析与报告计算平均菌落数：报告方式：菌落总数(cfu/ml)。cfu：colony forming units当检样的菌落数为l100时，按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字报告。国家标准（GB5749-2006）规定生活饮用水菌落总数每毫升不得超过100个。2023/5/242023/5/242121（二）水源水器材与试剂 无菌1ml吸管6支/组，无菌10ml吸管1支/组。无菌平皿9个/组，营养琼脂。90ml灭菌盐水1瓶（内置适量玻璃珠），9ml灭菌盐水管3支。2023/5/242023/5/242222方法 稀释水样：无菌吸10ml混匀水样注入90ml灭菌水瓶中,混匀成1:10水样。取1:10水样1ml注入9ml灭菌试管中混匀成1:100水样。同法稀释成1:1000,1:10000水样。2023/5/242023/5/242323方法 倾注培养：用1ml无菌吸管吸取23个适当浓度的稀释液1ml,分别注入无菌平皿中，每个稀释度应同时做2个平皿，另取一平皿作空白对照。再做倾注培养(方法同饮用水)。菌落计数：方法同饮用水。2023/5/242023/5/242424菌落总数测定2023/5/242023/5/242525结果分析与报告计算不同稀释度的平均菌落数：稀释度的选择和菌落总数报告方式：首先选择平均菌落在30300之间者进行计算。计算方法和报告方式如表1所示。菌落总数平板计数法2023/5/242023/5/242626表1稀释度选择及菌落总数报告方式例例次次不同稀释度的平均菌落数不同稀释度的平均菌落数两稀释两稀释度菌落度菌落总数之比总数之比 菌落总数菌落总数 (cfucfum1)m1)报告方式报告方式 (cfucfum1)m1)10-1 10-1 10-2 10-2 10-3 10-31 12 23 34 45 56 67 78 8136513652760276028902890150150多不可计多不可计2727多不可计多不可计0 0 164 164 295 295 271 271 30 3046504650 1l 1l3053050 02020464660608 85135135 512120 0 1.6 1.6 2.2 2.2 2 2 1640016400377503775027100271001 5001 50051300051300027027030500305001101101600016000或或1.61041.61043800038000或或3.81043.81042700027000或或2.71042.710415001500或或1.51031.5103510000510000或或5.11055.1105270270或或2.71022.71023100031000或或3.11043.110410102023/5/242023/5/242727由表2可判定水质被污染的程度。表2 一般水源水中菌落总数与水清洁程度的关系 水的类别最清洁水清洁水不太清洁水不清洁水极不清洁水菌落总数 cfum1101001001000100010000100001000001000002023/5/242023/5/242828注意事项菌落总数测定中，应选择合适的稀释度进行。（生活饮用水，国家标准规定每毫升不得超过100个，因此可以直接吸取1毫升到平板进行培养）各稀释管、相应平皿做好标记。包括：水样名称、稀释度、时间、小组。严格无菌操作。进行水样稀释时，每一稀释度均需更换吸管。倾注时，要注意营养琼脂的温度。倾入琼脂后要混匀，待琼脂凝固后倒置培养。2023/5/242023/5/242929三、总大肠菌群的测定多管发酵法分为三步：初发酵试验平板分离复发酵证实试验2023/5/242023/5/243030多管发酵法定义：总大肠菌群指一群在37培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。培养基：乳糖蛋白胨培养液 二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 伊红美蓝培养基 设备：显微镜2023/5/242023/5/2431312023/5/242023/5/243232初发酵试验：采用乳糖蛋白胨培养液37培养24h，观察产酸产气情况。平板分离：对阳性管培养物，接种于伊红美蓝培养基，观察菌落特征，并进行革兰氏染色和镜检。复发酵证实试验：对典型和可疑菌落，接种于乳糖蛋白胨培养液，进行复发酵证实试验.，结果报告（MPN）：根据标准所附检索表报告结果（MPN”最可能数”）。2023/5/242023/5/243333产气产气初发酵、复发酵试验结果初发酵、复发酵试验结果2023/5/242023/5/243434多管发酵法结果大肠菌群在伊红美蓝培养基上的典型菌落特征大肠菌群革兰氏染色显微镜下的形态 2023/5/242023/5/243535耐热大肠菌群多管发酵法耐热大肠菌群（thermotoletant Coliform Organisms）：在4444.5下具有与大肠菌群相同发酵及生物化学性能的菌群。2023/5/242023/5/243636耐热大肠菌群的测定 1.1基本性质 培养温度提高到4444.5，在此条件下仍能生长和发酵乳糖的菌群。埃希氏菌属：粪源特异性 耐热大肠菌群 克雷伯菌属 肠杆菌属总大肠菌群 柠檬酸菌属 其它(阴沟肠杆菌和弗氏柠檬酸杆菌)注意：耐热大肠菌在配水系统中是不能繁殖的，除非管网中有充足的营养物质（升华需氧量超过10/mgL）,以及管网中没有余氯。2023/5/242023/5/243737耐热大肠菌群的测定 1.2 主要用途 埃希氏大肠菌是最准确和专一的粪便污染指示。耐热大肠菌的检出，可认为近期水体直接或者间接地受到了粪便污染。注意：GB/5749-2006规定，如果饮用水检出总大肠菌群，就必须检测耐热大肠菌或者埃希氏大肠菌。2023/5/242023/5/243838多管发酵法定义：用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。培养基：1.EC培养基 2.伊红美蓝琼脂 设备：无特殊设备2023/5/242023/5/243939检测步骤初发酵（同总大肠菌群），24h耐热培养：阳性管接种（44.5度），24h平板培养：阳性管接种EMB平板，24h2023/5/242023/5/2440402023/5/242023/5/244141微生物指标检验方法的总结2023/5/242023/5/244242检验日程安排前一日：实验准备、采水瓶、培养基配制、灭菌采水当日：水样采集、倾注培养、初发酵试验。第二日：阳性管EMB平板分离+EC肉汤。第三日：涂片+革兰氏染色镜检、复发酵试验；EC阳性转EMB平板。菌落计数及结果报告。第四日：报告总大肠菌群MPN和耐热大肠菌群MPN。完成原始记录，并对所检测的水样进行综合分析，发检验报告。2023/5/242023/5/2443432023/5/242023/5/244444