单克隆抗体技术.pptx

汇报人：陈海云汇报人：陈海云 吴亚荣吴亚荣指导老师：余为一指导老师：余为一 主要内容主要内容：一、概念一、概念二、单克隆抗体的原理二、单克隆抗体的原理三、单克隆抗体的制备三、单克隆抗体的制备四、单克隆抗体的应用四、单克隆抗体的应用 1975年年 Kohler&Milstein创立单克隆抗体技术，获得创立单克隆抗体技术，获得19841984年诺贝尔医学和生理年诺贝尔医学和生理学奖学奖 创立者创立者：一、概念一、概念 多克隆抗体（多克隆抗体（PcAbPcAb）：病原微生物和天然抗原含）：病原微生物和天然抗原含有多种抗原决定簇，刺激机体免疫系统后，可形有多种抗原决定簇，刺激机体免疫系统后，可形成针对不同抗原决定簇的混合抗体。成针对不同抗原决定簇的混合抗体。单克隆抗体（单克隆抗体（mAb)mAb)：单个淋巴细胞克隆产生，针：单个淋巴细胞克隆产生，针对一种特定抗原决定簇的抗体对一种特定抗原决定簇的抗体。单抗和多抗产生区别单抗和多抗产生区别小鼠多克隆抗体（多克隆抗体（多克隆抗体（多克隆抗体（PcAbPcAbPcAbPcAb）与单克隆抗休（）与单克隆抗休（）与单克隆抗休（）与单克隆抗休（McAbMcAbMcAbMcAb）的比较）的比较）的比较）的比较项目项目PcAbPcAbMcAbMcAb抗体的制备抗体的制备用免疫血清用免疫血清用杂交瘤技术用杂交瘤技术抗体的浓度抗体的浓度0.1-1.0mg/ml0.1-1.0mg/ml（血清）（血清）10-100g/ml(10-100g/ml(培养上清培养上清)1-10mg/ml1-10mg/ml（血清）（血清）5-20mg/ml5-20mg/ml（腹水）（腹水）均一性均一性抗体组成复杂抗体组成复杂抗体组成单一抗体组成单一特异性特异性抗体批间有差异抗体批间有差异抗体批间无差异抗体批间无差异识别的抗原决定簇识别的抗原决定簇多多单一单一二、基本原理二、基本原理三、制备流程三、制备流程：材料准备材料准备实验动物实验动物：与骨髓瘤细胞供体同一品系的动物与骨髓瘤细胞供体同一品系的动物（BALB/cBALB/c小鼠小鼠 6-8 6-8周龄周龄 20-25g 20-25g）抗抗 原原：可溶性抗原或颗粒性抗原可溶性抗原或颗粒性抗原B B淋巴细胞：小鼠脾脏淋巴细胞：小鼠脾脏骨髓瘤细胞：与实验小鼠同一品系的动物骨髓瘤细胞：与实验小鼠同一品系的动物 细胞株保持细胞株保持HGPRTHGPRT缺陷状态。缺陷状态。常用骨髓瘤细胞常用骨髓瘤细胞SP2SP2/0 0、NS1NS1等。等。材料准备材料准备饲养细胞饲养细胞饲养细胞饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长 繁殖，若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长 繁殖，所加入的细胞称饲养细胞。繁殖，所加入的细胞称饲养细胞。小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏细胞、胸腺细胞小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏细胞、胸腺细胞。作用作用作用作用 营养作用营养作用 清洁作用清洁作用细胞融合方法细胞融合方法骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞B B细胞细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞-B-B细胞细胞 B B细胞细胞-B-B细胞细胞 B B细胞细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合融合筛选筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞方法：方法：电融合电融合 激光融合激光融合 离心融合离心融合 灭活的病毒融合灭活的病毒融合 聚乙二醇融合法聚乙二醇融合法脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为3:13:1或或5:1,5:1,最为常用。最为常用。大概大概1-21-2周后，小鼠腹部会膨胀，抽取小鼠腹水，可获得大周后，小鼠腹部会膨胀，抽取小鼠腹水，可获得大量单克隆抗体。量单克隆抗体。体内培养法体内培养法体外培养法体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养，收集培养上清液，将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养，收集培养上清液，离心去除细胞碎片，可获得单克隆抗体。离心去除细胞碎片，可获得单克隆抗体。杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选l1杂交瘤细胞的筛选l2单克隆抗体的应用筛选原理筛选原理o在实际免疫过程中，一种抗原决定簇只能刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。o第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞细胞细胞DNADNA合成途径合成途径1.主要途径：氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸 谷 氨 酰 胺 （A-）尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 2.替代途径：次黄嘌呤（H）HGPRT酶3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）TK酶HAT选择培养基的组分l次黄嘌呤（hypoxanthine,H)l胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)l氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂，是细胞合成DNA的阻断剂。正常B细胞利用HAT培养液中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，在 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGRPT）和胸腺嘧啶激酶 (TK)的催化下经旁路合成DNA。骨髓瘤细胞是遗传基因缺陷型的细胞系，缺乏HGRPT或TK。HGRPTHGRPT酶酶TK酶酶杂交瘤细胞的选择性培养杂交瘤细胞的选择性培养细胞生长情况细胞生长情况细胞生长情况细胞生长情况 融合后融合后3434天后，可见外形似天后，可见外形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮的克隆。骨髓瘤细胞，浑圆透亮的克隆。融合后第融合后第7979天取培养上清，天取培养上清，检测特异性抗体检测特异性抗体四、抗体的检测四、抗体的检测筛选：免疫酶技术免疫酶技术间接间接ELISAELISA免疫荧光技术免疫荧光技术ELISAELISA原理原理o将抗原包被于酶标板，与待检杂交瘤细胞上清液反应，如该上清液中含有特异性的抗体（一抗Ab），即可与酶标二抗作用，加底物经酶催化呈现颜色反应，通过检测OD值判定结果。杂交瘤细胞的克隆化杂交瘤细胞的克隆化o目的：建立单一细胞的克隆o方法：有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法o克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔计数0.1ml/孔单克隆抗体的应用医学上用作诊断试剂1 鉴别淋巴细胞2 鉴别病原体，诊断传染病3 肿瘤的诊断和分型4 激素类单抗用于判断内分泌的功能状态单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用o用作研究工具1.纯化抗原2.分析和探查抗原结构3.分析抗原决定簇分子的功能o用于疾病的治疗1.抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治2.抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗3.抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗 谢 谢