色谱联用技术.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第七章 色谱联用技术,7.1,色谱联用分析技术概述,1.,联用技术的必要性,每种分析方法都有其特长和局限性。局限性来自两个方面：,原理方面，不可逾越；,技术方面，可以改进、发展。,在线联用不仅能取长补短，而且还具有协同作用，获得两种技术单独使用时所不具备的某些功能。,2,2.,实现在线联用的关键,硬件接口（,hardware interface,）,用于协调联用的两种仪器的输出和输入之间的矛盾，使两种仪器连接成一个整体。,3,3.,色谱联用技术发展现状,色谱：分离,光谱：结构鉴定,两者联用，不仅可以对混合物中的各未知组分进行定性，也可用于定量分析。,GC-MS,GC-FTIR,LC-MS,LC-FTIR,LC-NMR,LC-ICP-AES,4,7.2,气相色谱质谱联用,GC-MS,5,1.,气相色谱与“四谱”工作条件的适应性,6,2,、气质联用接口（协调输出,/,输入的矛盾）,工作气压不匹配是实现,GC,MS,联用的主要困难。,GC,柱的输出为,100 kPa,，而,MS,离子源在小于,10,3,Pa,的条件下工作。,接口的作用是将,GC,流出的载气气压降低到,MS,能够接受的程度，并将样品送入,MS,离子源,接口的类型,喷射式分子分离器，早期，适合于填充柱；,通过传输线直接连接，适合于毛细管柱。,7,喷射式分子分离器的结构,作用：降低气压；浓缩样品。,出口,气相色谱,高真空泵,传输线,化学工作站软件（计算机）,离子源,质量分析器,机械泵,检测器,质谱,3.,仪器结构,9,GC-MS,组成：,GC,：,低流失毛细管柱,载气必须用,99.999%,的,氦气,离子源：,电子轰击源、,化学电离源,MS,：,四极杆质谱仪、,离子阱、飞行时间质谱仪,接口：,细口径毛细管柱,通过传输线直接连接,粗口径,分流,数据系统：,计算机 数据库,真空系统：,分子涡轮泵,10,4,、质量分析器,四极杆质量分析器,飞行时间质量分析器,离子阱质量分析器,磁质量分析器,傅里叶变换离子回旋共振质量分析器,多个质量分析器的串联（串联质谱联用）,11,1.,四极杆质量分析器,（,Quadrupole Mass Filter,）,+,Electron Beam,A,B,C,Sample in,Ion Beam,对于给定的直流,DC,和射频电压,RF,，特定质荷比的离子在轴向稳定运动，其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。将,DC,和,RF,以固定的斜率变化，实现质谱扫描功能。,12,特点：,（,1,）结构简单，体积小，价格便宜,（,2,）扫描速度快，与色谱出峰速度匹配，适合联用,（,3,）可串联使用,（,4,）无需狭缝分离，灵敏度高,（,5,）质量分辨率不高,(,小数点后,1,位）,（,6,）检测的,m/z,范围小,13,2,.,离子阱质量分析器,(ion trap),特定,m,/,z,离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同,m/z,离子飞出阱到达检测器；,14,特点：,（,1,）结构简单，体积小，价格低,（,2,）扫描速度快，与色谱出峰速度匹配，适合联用,（,3,）自身可做多级，有利于定性,（,4,）质量分辨率,6000-9000,（,5,）检测的,m/z,范围小,15,3.,飞行时间质量分析器,(TOF),具有相同动能、不同质量的离子，其飞行速度不同而分离。如果固定离子飞行距离，则不同质量离子的飞行时间不同，质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。,16,特点：,（,1,）结构简单，体积较大，价格略贵,（,2,）扫描速度快，与色谱出峰速度匹配，适合联用,（,3,）灵敏度高,（,4,）质量分辨率高,（,5,）检测质量无上限,17,气相色谱,-,四极杆质谱仪,18,4.,气质联用系统提供的信息,GC-MS-Computer,的工作过程：,GC,：各组分被色谱柱分离，随时间变化依次从柱子流出，通过接口进入,MS,。,MS,：连续扫描,MS,图，每扫描一张,MS,图需花费约零点几到几秒钟。总扫描时间,(,扫一张图谱的时间,),扫描次数,计算机：将得到的所有,MS,数据存储起来，供下一步的处理和输出。,20,(1),总离子流图（,TIC,）,质谱仪检测到的所有离子信号（不分其质荷比）的总和对时间,t,作图,相当于气相色谱图。没有组分通过时为基线；当组分流出时，即出现峰。,记录方法：,TIC,检测器；,计算机采集和存储连续、重复扫描的信息，然后进行数据处理。,21,TIC,图中的每一个峰代表一个组分；,峰的位置就是该组分的色谱保留时间；,峰面积与组分的相对含量有关。,某种天然蜡质衍生物的,GC,MS,总离子流图,22,(2),每个组分的质谱图,可从质谱图获得组分的分子量和分子结构信息。,谱库检索,根据,NIST,，,INCOS,，,PBM,三种算法，将未知物图谱与谱库中的标准图谱比较，匹配度越高，可信度越高,88,101,396,23,序号 化合物名称序号 化合物名,1,十六碳酸,12,二十九碳烷,2 9,12-,十八碳二烯酸,13,三十碳烷,3,十八碳酸,14,二十六醇乙酸酯,4,二十四碳烷,15,三十一碳烷,5,二十醇乙酸酯,16,结构未定*,6,二十五碳烷,17,三十二碳烷,7,二十六碳烷,18,二十八醇乙酸酯,8,二十二醇乙酸酯,19,结构未定,*,9,二十七碳烷,20,三十四碳烷,10,二十八碳烷,21,三十醇乙酸酯,11,二十四醇乙酸酯,22,25,结构未定*,由,GC,MS,确定的,某天然蜡衍生物的成分,24,(3),质量色谱图（提取离子流图）,以,指定质荷比,的离子强度（而不是总的离子流强度）对时间,t,（或扫描号）作图。,是计算机进行数据处理得到的图。,优点：可在复杂混合物的,TIC,图中,迅速找到所需检测的化合物或同系物。,25,某天然蜡衍生物的总离子流图和质量色谱图,（用于寻找一类成分）,26,1.0,2.0,3.0,4.0,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,质量色谱图,总离子流图,（用于寻找微量成分）,27,5.GC-MS,的应用,凡是能用气相色谱分析的试样，均适合于,GC-MS,分析，如,环境污染物的分析,香精、香料的成分分析和质量评价,中草药的挥发性成分鉴定,药物及其他化工产品的分析,毒物、毒品及违禁药物的鉴定和检测等等。,28,（,1,）,GC-MS,定性分析,分析条件的设定,GC,条件：同普通,CGC,MS,条件：扫描方式，扫描范围，扫描速度,灯丝电流，倍增器电压等,定性分析,进样，电离，质谱数据的采集，谱图检索,29,GC-MS,定量分析依据,用总离子色谱图定量,用质量色谱图（提取离子色谱图）定量,用选择离子色谱图定量（,SIM,，选择离子监测）,对串联质谱还可以用,MRM,（,SRM,，反应离子监测）定量,优缺点,GC-MS,定量分析方法：内标法，外标法，归一化,（,2,）,GC-MS,定量分析,30,有机氯农药的,GC-MS,总离子流图,31,32,7.3,液相色谱,-,质谱联用技术,LC-MS,一、实现,LC-MS,的困难,1.LC,流动相对,MS,工作条件的影响,1ml,溶剂气化生成,500-1300ml,的蒸气，而质谱仪只能接受,10 ml/min,气体流量。,有时流动相中含难以挥发的缓冲盐,2.,质谱离子源温度、电离方式不适宜液相色谱所分析的样品。,34,二、接口系统,1.,脱溶剂,2.,使被测物电离,35,1.,粒子束接口（,Particle-Beam,PB,）,根据流体力学原理，利用样品与溶剂动量的不同将它们分开,形成气溶胶脱溶剂动量分离,得到的谱图与电子轰击质谱图非常相似，可利用标准谱图检索,现少使用,36,EI,PB,37,2.,电喷雾电离（,ESI,，接口,+,软电离技术）,Rayleigh,Limit,Reached,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,-,-,+,+,+,+,+,+,-,-,Evaporation,+,+,Charged Droplets,试样离子,准分子离子,Analyte Ions,Solvent Ion Clusters,Salts/Ion pairs,Neutrals,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,其他离子,38,电喷雾电离，,Electrospray,流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘。,气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶剂分子,39,特点：,是,LC-MS,的基本配置,接口,是一种,软电离方式,，适合稳定性差、极性大、分子量大的物质的电离。,主要生成准分子离子（,M+H,+,、,M-H,-,、,M+Na,+,等,），,生物大分析产生多电荷离子。,灵敏度高,不能进行谱库检索,不,适用于非极性化合物的分析,40,对于大分子化合物，电喷雾产生多电荷离子，相对分子质量,M,r,计算方法如下：,选相邻峰，电荷,n,，,n,+1,m,1,=(,M,r+,n+,1)/(,n+,1),m,2,=(,M,r +,n,)/,n,41,分子量约为,12200,的细胞色素的,ESI,质谱图,42,3.,大气压化学电离,(Atmospheric Pressure Chemical Ionization,APCI),电离主要生成溶剂离子,样品分子与溶剂离子反应生成离子簇,离子去簇后送到质谱计中,MS,放电针,喷雾,LC,43,热喷雾,(100-120,C,),，化学电离,;,适用于弱极性和热稳定化合物分析,.,44,特点：,化学电离，软电离技术，产生的碎片很少,适用于弱极性、分子量小（,2000Da,）和热稳定化合物分析,灵敏度高,ESI,的补充技术,45,ESI APCI,硬件,毛细管有几千伏高压 放电针,电离,液滴中的离子蒸发 类似于化学电离,原理,属于液相电离 属于气相电离,应用,*适合的,LC,流速为,0.2,2ml,/,min,0.2,0.3ml/min,*,极性和离子化合物 极性较小的化合物,*可产生多电荷离子 产生单电荷离子,46,LC-MS(,四极杆,),联用仪器结构示意图,47,LC-MS(,离子阱,),联用仪器结构示意图,48,医药、临床：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析、疾病诊断,生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖,环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤,/,食品,/,水分析,食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物,化学：有机合成物,三、液质联用的应用,49,%,%MultiView-1996,SCIEX,a division of MDS Health Group.,%,%Original concept:,%Dr.Ron Bonner,%Dr.Lyle Burton,%,%Development:,%Dr.Lyle Burton,%Yves Legault,%Shengping Ma,%,%With the help of:,%Dr.Victoria Barclay,%Scott Champ,%Rob McDermid,%,%,%MultiView-1996,SCIEX,a division of MDS Health Group.,%,%Original concept:,%Dr.Ron Bonner,%Dr.Lyle Burton,%,%Development:,%Dr.Lyle Burton,%Yves Legault,%Shengping Ma,%,%With the help of:,%Dr.Victoria Barclay,%Scott Champ,%Rob McDermid,%,%,%MultiView-1996,SCIEX,a division of MDS Health Group.,%,%Original concept:,%Dr.Ron Bonner,%Dr.Lyle Burton,%,%Development:,%Dr.Lyle Burton,%Yves Legault,%Shengping Ma,%,%With the help of:,%Dr.Victoria Barclay,%Scott Champ,%Rob McDermid,%,.,2,4,6,8,10,12,14,Time,min,200,400,600,800,1000,1200,1400,1600,1800,2000,2200,2400,2600,Intensity,cps,tanshinone I,tanshinone IIA,cryptotanshinone,dihydrotanshinone,TIC Spectrum of Four Diterpenoids of Radix Salviae Miltiorrhizae,丹参中四种丹参酮的,lc-ms-ms,测定,50,LC-MS-MS MRM Chromatograms of Radix Salviae Miltoirrhizae Sample,反应离子监测,51,7.4,高效液相色谱,-,核磁共振,联用技术,LC-NMR,52,一、,HPLC,与,NMR,的比较及联用的困难,HPLC NMR,分析对象,有机物,样品状态,液态,操作温度,室温,扫描时间,大体相同,操作方式,连续流动 间歇,灵敏度,g,ng mg,溶剂,普通 氘代溶剂,53,二、问题的解决,主要取决于核磁共振技术的提高和发展,（,1,）灵敏度,仪器方面,高频仪器的使用：,NMR,的信噪比与磁场强度的平方成正比，,800 MHz(18.79T),与,100 MHz(2.35T),仪器相比，信噪比增大约,64,倍。,用新技术提高信噪比：软件滤波，消噪技术,54,操作参数的影响,提高,LC,柱的负载量 内径,4.6mm,色谱柱，合适的负载量为,100,g,。,采用停流技术 增加检测的有效时间（多次扫描累积）。,把射频线圈直接绕在流通池壁上，减少死体积。,（,2,）溶剂,使用氘代溶剂,使用脉冲序列等溶剂抑制技术,55,采用,WET,序列进行溶剂峰抑制的实例,乙腈溶剂峰,56,三、联用方式,实验布局,泵、注入阀、色谱柱和紫外检测器组成的,LC,系统，通过一条,2-2.5m,的特制毛细管连接到,NMR,液相探头上，探头底部有阀控制,NMR,测定方式。,57,58,液相探头带有一个流动腔；,射频发射线圈垂直固定在流动腔的玻璃管上；,接受线圈平行于玻璃管；,流动腔不能旋转，,NMR,测定分辨率较差。,59,联用模式,连续流动模式,LC,的载液带着试样组分连续不断流入,NMR,的流动腔，,NMR,仪器用溶剂峰抑制技术采集,NMR,谱图，得到化学位移,LC,保留时间的假二维谱。得到的谱图分辨率和信噪比差。,停流技术（时间切割谱）当色谱峰的最高点到达流动腔的检测位置时，关闭液相探头底部的进口阀，同时,LC,的泵停止工作，,NMR,进行采样直到获得满意的谱图。,60,峰存储模式,(peak parking),实际上是一种离线模式。,由,LC,流出的峰存储在毛细管回路中，然后通过适当的阀系统依次送入,NMR,探头中,进行,NMR,测定，,LC,分析过程不中断。,体系中有三个阀，,12,个存储峰的毛细管回路，整个过程由计算机控制。,61,峰存储模式,62,三种联用模式的比较,流动模式：灵敏度和信噪比差，适合于测定富核，如,1,H,、,19,F,、,31,P,和富集的,13,C,、,15,N,；对,1,H,最小检测量（,16,次累加）为,10,g,（,500MHz,），,30g,（,300MHz,）；,停流模式：有较好的灵敏度，可测,1,H,、,13,C,、,15,N,等。最小检测量,1,H,为,1,g,；,峰存储模式：与停流模式类似。,63,应用实例,耐哌地尔杂质的检测,64,7.5,色谱,-,傅立叶变换红外光谱联用,(GC-FTIR),65,1.GC-FTIR,联用概述,（,1,）,GC-IR,联用的作用,MS,一般难于区分,同分异构体,，,IR,是很好的补充。,（,2,）实现,GC-IR,的困难,扫描速度、灵敏度、物理状态,均不匹配,（,3,）解决方法,FTIR,：具有信噪比好、扫描速度快,等优点,，与,GC,的匹配性大大提高。,物理状态：测,气体红外。,66,2.GC-FTIR,系统,FT,IR,光学台,数据系统,GC,MCT,检测器,GC,FT,系统的示意图,光管,67,68,GC-FTIR,接口示意图,69,接口,-,光管,用硼硅玻璃制成；,两端装有,KBr,盐窗，红外干涉光可以通过；,内壁镀金，有高的反射率，红外干涉光在其中多次反射，增加光程以提高灵敏度；,可加热，保证,GC,流出物不在此冷凝；,适当的容积，以获得最佳分辨率和灵敏度；,尾吹装置：用以解决毛细管,GC,柱与传输线（,i.d.2mm,）、光管,(1mm),中线速变化的问题。即柱外效应的问题,70,3.GC-FTIR,提供的信息,(1),三维实时显示图,波数,时间,吸光度,71,(2),化学图（,Chemigram,）,(,官能团色谱图,),指定官能团频率范围对时间所作的图；,是一个“色谱图”，每个峰代表一个组分；,包含的信息比一般的色谱图多，它体现了化合物类型或所含官能团的信息；,与,GC-MS,中的质量色谱图作用相似。,72,1200,1100,1600,1500,1780,1680,3050,2950,3650,3550,乙醇、丙酮、乙酸乙酯和苯的混合物的化学图,73,(3),红外重建色谱图,GC-FTIR,采集的数据经计算机处理后得到的红外吸收信号对时间所作的图。,积分吸收重建图,(,红外总吸光度重建图,TIA),，相当于,GC-MS,中的总离子流图,(TIC),。,Gram-Schmidt,重建色谱图,扣除了载气背景的积分重建图。,最大重建色谱图,对每个峰的最大吸收进行积分重建,相当于,GC-MS,中的,RTIC,图,。,74,积分吸收重建图,75,Gram-Schmidt,重建色谱图,76,(4),蒸气相红外吸收光谱图,乙醇 丙酮,77,四、,GC-FTIR,应用实例,与,GC-MS,相比,在鉴定同分异构体方面占优势。,如芳环的替代位置，顺反异构，环连接方式，环上异构等,存在问题：,灵敏度比,GC-MS,低，一般低两个数量级。,高沸点样品的分析有困难。因光管使用温度受限制。,蒸气相红外光谱图库中谱图数量较少。,78,五、,GC,FTIR,MS,联用,一次进样便可获得分离及红外、质谱互补的鉴定信息。更加省时、省力、省样。,在,1987,年出现商品仪器。,GC,进样后，可实时、同时显示,红外的总响应图,（,TRC,）、,质谱的总离子流图,（,TIC,）及每次扫描的,蒸气相红外光谱图和质谱图,，并可对指定组分的红外、质谱进行,谱库检索,，,自动找出最佳匹配结果。,联机方式：串联、并联,79,串 联,并联,分流,80,6,种毒品的三机联用分析结果,81,组分,1,(,咖 啡 因,),组分,2,(,美 洲 酮,),82,