第七章发酵工程制药-生物技术制药.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 发酵工程制药,1,第一节 概述,一、发酵工程,微生物工程,:,自催化过程,完整的工业体系,2,(,一,),发酵的定义,1,、传统发酵,最初发酵是用来描述酵母菌,作用于果汁或麦芽汁产生气,泡的现象，或者是指酒的生,产过程。,3,2,、生化和生理学意义的发酵,指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。,如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出,CO,2,。,4,3,、工业上的发酵,泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程,包括：,1.,厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。,2.,通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。,产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。,5,(,二,),发酵工业,定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，无机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。,6,发酵食品,有机酸,氨基酸,核酸类物质,酶制剂,医药工业（抗生素,）,饲料工业（单细胞蛋白,环境工程（废物处理）,其它（冶金工业,）,抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、,有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、,生物农药、生物肥料等,(1),传统生物技术,7,(2),现代生物技术,基因工程菌发酵,8,二、发酵类型,1,、微生物菌体发酵,定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。药用微生物制剂等。,9,特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。,10,2,、微生物的酶,目前的酶多数来源于微生物发酵,医用酶制剂的生产,医药工业用酶,酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。,生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。,11,3,、微生物代谢产物发酵,包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。,对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。,各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所,产生的，来自于中间代谢,产物和初级代谢产物。,12,1,3-,丙二醇两步发酵法,糖,甘油,1,3-,丙二醇,酵母,伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等,13,4,、微生物的生物转化,定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更多经济价值的化合物。,最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。,14,15,三、微生物发酵生产药物的分类,（一）抗生素类,9000,种,微生物发酵占,70,。有价值的抗生素，几乎全部由微生物生产,抗细菌，病毒，真菌，肿瘤，原虫，寄生虫等,16,（二）氨基酸类,单个氨基酸制剂：,复方氨基酸制剂：,微生物发酵法：,酶转化法,黄色短杆菌合成赖氨酸的途径,17,（三）核苷酸类,肌苷酸，肌苷，,AMP,，,ATP,，辅酶等,18,（四）维生素类,维生素,C,的原料药,2-,酮基,-,古龙酸，维生素,A,的前体,B-,类胡萝卜素，维生素,D2,的前体麦角甾醇，维生素,B2,，,B12,等,19,（四）甾体类激素,甾体类激素的生产过程中，,一些特异反应需借助微生物的反应。,20,（五）治疗酶及酶抑制剂,药用酶,酶抑制剂,21,四、发酵工程制药特点及发展趋势,（,1,）菌种是根本,（,2,）理论产量存在,“,生物学变量,”,（,3,）常温常压下反应，安全，条件简单,（,4,）纯种培养，防污染,（,5,）可制备复杂高分子化合物,（,6,）分子水平，定向发酵，组合生物合成等,（,7,）发酵工业成本低,22,菌种选育,自然界选种、诱变育种、基因工程、细胞工程,培养基配制,根据培养基的配制原则制备，实践中需多次试验配方,灭菌,杀灭杂菌（胞体、孢子及芽孢）,扩大培养和接种,发酵过程（中心阶段）,检测进程，满足营养需要；严格控制温度、,pH,、溶氧、转速等,分离纯化,菌体：过滤、沉淀；代谢产物：蒸馏、萃取、离子交换,发酵工程基本流程,23,发酵的基本过程,发酵的基本过程,:,菌种 种子制备 发酵 预处理 提取精制,24,典型发酵过程,25,第二节、发酵工程中的微生物,一、常见的药用微生物,发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌,细菌,放线菌,26,（一）细菌,主要生产氨基酸，核苷酸，维生素等,27,（二）,放线菌,产抗生素最多的一类微生物,另外生产,B12,酶，甾体转化,抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：,放线菌（链霉素；四环素；红霉素等）,真菌（青霉素、头孢等）,一些产芽孢的细菌,植物或动物来源,链霉菌,28,（三）真菌,抗生素,维生素,酶制剂,有机酸等,药用真菌（大型真菌）,29,1.,藻状菌纲：根霉；犁头霉,2.,子囊菌纲：酵母,3.,担子菌纲：牛肝菌，灵芝,4.,半知菌纲：曲霉；青霉；头孢酶,30,二、生产菌种的选育,工业化菌种的要求,1.,遗传性能要相对稳定,2.,生长速度快，不易感染它种微生物或噬菌体,3.,目标产物产量接近理论转化值,4.,目标产物分泌到胞外,5.,尽可能减少类似物产量,6.,能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物,31,自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为,10,-8,10,-9,一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变,。,另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。,（,1,）自然选育,32,1,采样,33,2.,分离菌株,34,自然选育操作步骤：,一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。,平板分离,(,注意形态的观察,),发酵试验,单细胞,(,孢子,),悬液的制备,挑选单菌落,礼来公司花了,10,年的时间从,40,万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。,35,（,2),自发突变与定向育种,一定情况下，长期处理微生物并移种，累积自发突变体,结构类似物,：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。,筛选抗性株，可成为高产株,抗性突变株的筛选,36,直接从自然界分离得到的菌株为,野生型菌株,。往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产,菌种选育,突变、体内重组,体外重组（基因工程）,37,（,3,）诱变育种,用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种,诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂,诱变剂,物理：紫外线，快中子,化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍,5-Br-U,38,物理诱变剂,：紫外线、,X-,射线、,-,射线，快中子；目前使用得最方便而且十分有效的是,紫外线,。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。,化学诱变剂,：碱基类似物、,5-,氟尿嘧啶、烷化剂等。使用最多、最有效的是,烷化剂,。大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效,39,诱变育种步骤,出发菌株的选择,处理菌悬液的制备,诱变处理,中间培养,分离和筛选,筛选的方法,随机筛选,形态,理性化筛选,40,（,4,）杂交育种,通过有性生殖进行,41,(5),原生质体融合,两个细胞融合,1.,原生质体融合的一般程序,去细胞壁融合筛选,2.,酶,溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶,42,基因突变：,自然选育、诱变育种,基因重组,：,杂交、原生质体融合、基因工程,基因的直接进化,：,点突变、易错,PCR,、同序法,DNA Shuffling,等,（,6,）基因重组进化育种,43,44,错位,PCR,45,基本步骤,(1),用,DNase I,消化功能相同的一组基因片段,(A),，从而产生随机小片段,(B),。,(2),经提纯后，用无引物,(,经变性后可互为引物,),的类似,PCR,反应重新装配这些小片段成完整长度的重组基因片段,(C),，在装记过程中被证明有低水平点突变产生。,3),克隆并选择正突变体,(D),，并将正突变体的重组基因片段作新一轮的体外重组。,46,项目,进化速度,进化对象,进化,周期,影响对象,突变效率,常规定向进化,缓慢进化,整个基因组,多年,完整基因组,低,DNA,Shuffling,快速进化,特定基因,/,操纵子,/,病毒,几天,部分基因组,高,DNA Shuffling,与常规定向进化的比较,47,从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。,1.,自身耐药突变株,2.,结构类似物或前体类似物的耐受突变株,3.,营养缺陷及其回复突变株,筛选,48,饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈,指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液,固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。,利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物 能力，工具菌就能围绕该菌生长,待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质,49,三、菌种保藏,在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。,斜面低温法：短期保存,石蜡油封存法：中期保存,沙土管：产孢子和芽孢的,麸皮保存法：产孢子的霉菌和放线菌，工厂用,甘油悬液法：基因工程菌,50,冻干保藏：最广泛使用的方法。大部分菌种可以在冻干状态下保藏,10,年之久。且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输,液氮法：最为有效，保藏,15,年以上，,宿主保藏法：活细胞内寄生的微生物,51,第三节、发酵设备及消毒灭菌,一、发酵设备,52,发酵罐是发酵工程中最重要的设备之一,一个优良的培养装置应具有：,严密的结构,良好的液体混合性能,高的传质和传热速率,灵敏的检测和控制仪表,53,1,、搅拌釜式反应器：目前使用最广泛的发酵反应器,54,55,机械搅拌发酵罐,1,）适宜的径高比，罐身较长，氧利用率较高,2,）能耐受一定的压力,3,）搅拌通风装置,4,）足够的冷却面积,5,）罐内要减少死角,6,）搅拌器的轴封要严密，以减少泄露,56,罐体：,培养微生物的巨大容器，密闭式的，在发酵过程中要保持一定的罐压，通常灭菌的压力约为,2.5,10,5,Pa,形状，圆柱形，两端椭圆形,受力均匀，减少死角，物料容易排除，,高度与直径比,1.7-4,：,1,，有力空气利用率,57,搅拌器,档板,克服搅拌器运转时液体产生的涡流，将径向流动改变为轴向流动，促使液体激烈翻动，增加溶氧速率,消泡器,锯齿式、梳状式及孔板式,装于搅拌轴上，齿面略高于液面,直径罐径的,0.80.9,58,59,罐体表面各种装置：,中大型发酵罐装有供维修、清洗的入孔,罐顶装有窥镜和孔灯，在其内面装有压缩空气或蒸汽吹管,罐顶接管：进料管、补料管、排气管、接种管、压力表接管,罐身接管：冷却水进出管、空气进管、温度计管和测控仪器接口,60,（二）发酵辅助设备,无菌空气系统：过滤除菌（使用活性炭，石棉滤板，多孔合成树脂等）,灭菌系统,发酵车间的管道阀门等,61,发酵对无菌空气的要求是：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标；,发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。,在工程设计中一般要求,1000,次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为,N=10,-3,62,高空取气管是远离地面几十米的管子。,地面附近空气中所含的微生物和灰尘等均比高空空气中含的多，每升高,10,米，空气中杂菌可降低一个数量级,因此从高空取气要比从低空取气有利得多。,63,油水分离器,其内部同时采用直接拦截，惯性碰撞，布朗扩散及凝聚等机理，能有效地去除空气中的水、油雾、尘埃，内部不锈钢丝网可清洗，使用寿命长。,64,发酵车间的空气过滤器,65,二、培养基和灭菌,（一）培养基,C,源：,N,源：,无机盐：,前体，促进剂，抑制剂,66,2.,培养基的类型,孢子培养基：一般用固体培养基，,N,源不能丰富如：小米或麸皮培养基,种子培养基：速效的,C,N,源，与发酵培养基过渡,发酵培养基：迟效与速效的,C,N,源搭配，加前体等,67,（二）灭菌方法,1.,空罐灭菌：高压水蒸气，消灭死角,当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌,蒸汽下进上出,68,2.,实罐灭菌：效果最好，,121,度，,30-50,分钟,三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。,69,3.,连续灭菌：营养破坏最少，,128-138,度，,8-12,分钟,。,70,发酵的流程,空气,空气净化处理,保藏菌种,斜面活化,扩大培养,种子罐,主发酵,碳源、氮源、无机盐等营养物质,灭菌,产物分离纯化,成品,71,二、种子的制备,种子扩大培养是指将保存在,砂土管,、,冷冻干燥管,中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为,种子,。,谷氨酸生产的种子制备,斜面菌种,一级种子培养,二级种子培养,发酵,72,1,、斜面,培养基：蛋白胨,1%,，牛肉膏,1%,，氯化钠,0.5,琼脂,2%,，,pH 7.0-7.2,培养基特点：,有利于菌体的生长，原料比较精细,培养条件：,32,，生长,18-24,小时,生长斜面要求：,生长良好，所使用斜面连续传代不超过,3,次,73,2.,一级种子（摇瓶）,培养条件：于,1000ml,三角瓶中，装液,200-250ml,32,培养,12h,培养基：葡萄糖,2%,，尿素,0.5%,，玉米浆,2.5%,，,K,2,HPO,4,0.1%,培养基特点：,有利于菌体的生长，所使用的原料已经基,本接近于发酵培养基,74,3.,二级种子,(,种子罐,),培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的,1%(,10%,),），,32,培养,7-10,个小时,培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为,2.5%,培养基的特点,：长菌体，更接近于发酵培养基,75,实验室阶段：,不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。,生产车间阶段,：,种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。,种子制备的过程,76,二、,微生物的发酵方式,分批培养,补料分批培养,连续培养,77,一、分批发酵,简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。,优点 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握,缺点 产率低，不适于测定动力学数据,78,79,分批培养中微生物的生长,迟滞期,对数生长期,稳 定 期,死亡期,80,迟滞期，菌体没有分裂只有生长。,对数生长期,当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快。,随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期,对于,初级代谢产物,，在对数生长期初期就开始合成并积累，而,次级代谢产物,则在对数生长期后期和稳定期大量合成。,81,二、补料分批培养,在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。,在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多,82,补料分批培养的优缺点,优点,在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。,缺点,由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会,83,三、半连续培养,补料分批培养基础上，加上间歇放掉部分发酵液进入下游提取的操作方式。某些品种采取这种方式，如四环素发酵,优点,放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。,缺点,代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大,84,四、连续培养,发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。,达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。,85,1.,罐式连续发酵,培养液以一定的流速不断地流加到带机械搅拌的发酵罐中，与罐内发酵液充分混合，同时带有细胞和产物的发酵液又以同样流速连续流出。如果用一个装置将流出的发酵液中部分细胞返回发酵罐，就构成循环系统。,86,87,88,2.,管式连续发酵,发酵液通过没有混返的管状反应器向前流动,管道的形式有多种，如直线形、,S,形、蛇形管等。培养液和从种子罐来的种子不断流入管道发酵器内，使微生物在其中生长。,这种连续发酵的方法主要用于厌氧发酵。如在管道中用隔板加以分隔，每一个分隔等于一台发酵罐，就相当于多罐串联的连续发酵。,89,连续培养的优缺点,优点,：控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学,缺点,：菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。,90,发挥菌种的最大生产潜力考虑之点,菌种本身的代谢特点，生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率,菌代谢与环境的相关性，温度、,pH,、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等,91,三、发酵过程中的中间分析项目,92,（一）产量,发酵液中发酵产物的积累，以发酵单位表示,化学测定法：简单，但受结构类似物的影响，发酵过程中采用。,生物测定法：麻烦，人为误差大。发酵终点采用,93,（二）,PH,pH,与微生物的生命活动密切相关,-,酶催化活性,pH,的变化又是微生物代谢状况的综合反映,-,基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况,94,（三）糖,糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况；,反映产物合成的活力,菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节,pH,，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。,95,糖含量测定包括总糖和还原糖。,总糖,指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。,还原糖,指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。,96,（四）氨基氮,氨基氮,指有机氮中的氮,氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。,但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。,发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。,97,（五）菌丝形态,98,四、发酵过程的影响因素及控制,发酵过程控制是发酵的重要部分,同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次会得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素是复杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一般方法对于控制代谢是十分必要的,99,（一）菌体浓度的影响及控制,菌体浓度反应菌体细胞数和胜利特性,结构越复杂的生物，分裂所需时间越长,发酵中菌液需控制在合理浓度中，过高，营养消耗过快，有毒废物积累，改变菌体代谢途径，影响溶氧；过低，产率下降,依靠调节培养基和补料控制菌体浓度,100,（二）培养基的影响及其控制,1.,碳源,葡萄糖速效碳源，生长菌体,淀粉等迟效碳源，发酵次级代谢产物,一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。,101,2.,氮源,氨基酸，玉米浆等速效氮源，生长菌体,豆饼等迟效氮源，发酵次级代谢产物,氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。,102,3.,磷酸盐和微量元素,微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根,抗生素对磷酸盐浓度很敏感,生长浓度：,0.32-300 M,生产浓度：,1.0 M,采用生长亚适量磷酸盐浓度,103,4.,补料,补基质和前体,中途补料，丰富培养基，避免菌体过早衰老，控制,PH,，改善通气等,通常在生长旺盛期后期，发酵液泡沫位下降，这时耗氧大，溶氧水平接近临界点,补料少量多次,104,（三）温度的影响及其控制,1,、温度影响反应速率,发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。另外，温度影响发酵液的物理性质,2,、温度影响发酵方向,四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于,30C,时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到,35C,时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。,105,1.,影响发酵温度变化的因素,(1),生物热,微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。,(2),搅拌热,(3),蒸发热,通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热,(4),辐射热,发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。,106,2.,温度的选择与控制,(1),最适温度的选择,嗜冷菌适应于,0,26,度生长，嗜温菌适应于,15,43,度生长，嗜热菌适应于,37,65,度生长，嗜高温菌适应于,65,度以上生长,最适生长温度，最适生产（发酵）温度,107,发酵前期,要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；,中期菌量,已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。,发酵后期,，产物合成能力降低，提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素生长阶段,28C,，合成期,26C,后期再升温；黑曲霉生长,37C,，产糖化酶,32,34C,。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长,30,32C,，产酸,34,37C,。,108,(2),温度的控制,冷却水,109,（四）,pH,的影响及其控制,pH,与微生物的生命活动密切相关,酶催化活性,pH,的变化又是微生物代谢状况的综合反映,基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况,通过观察,pH,变化规律可以了解发酵的正常与否,110,1,、发酵过程的,pH,控制,发酵过程中,pH,是不断变化的，通过观察,pH,变化规律可以了解发酵的正常与否,2,、产物形成,某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液,pH,变化。如有机酸类产生使,pH,下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使,pH,上升。,3,、菌体自溶，,pH,上升，发酵后期，,pH,上升,111,实例：,pH,对林可霉素发酵的影响,林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液,pH,下降，待有机酸被生产菌利用，,pH,上升。若不及时补糖、,(NH4)2SO4,或酸，发酵液,pH,可迅速升到,8.0,以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。对照罐发酵,66,小时,pH,达,7.93,，以后维持在,8.0,以上至,115,小时，菌丝浓度降低，,NH2-N,升高，发酵不再继续。,发酵,15,小时左右，,pH,值可以从消后的,6.5,左右下降到,5.3,，调节这一段的,pH,值至,7.0,左右，以后自控,pH,，可提高发酵单位。,112,发酵过程,pH,变化的原因,（,1,）糖代谢：特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使,pH,下降。糖缺乏，,pH,上升，是补料的标志之一,（,2,）氮代谢：当氨基酸中的,-NH2,被利用后,pH,会下降；尿素被分解成,NH3,，,pH,上升，,NH3,利用后,pH,下降，当碳源不足时氮源当碳源利用,pH,上升。,（,3,）生理酸碱性物质利用后,pH,会上升或下降,113,1.,调节好基础料的,pH,。基础料中若含有玉米浆，,pH,呈酸性，必须调节,pH,。若要控制消后,pH,在,6.0,，消前,pH,往往要调到,6.5,6.8,.,在基础料中加入维持,pH,的物质，如,CaCO3,，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等,.,通过补料调节,pH,.,当补料与调,pH,发生矛盾时，加酸碱调,pH,114,（五）溶氧的影响及其控制,溶氧,(DO),是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为,控制,因素。,供氧不足，代谢异常,通气，搅拌,115,1.,溶氧的影响,在,28,氧在发酵液中的,100,的空气饱和浓度只有,0.25 M,左右，比糖的溶解度小,7000,倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到,100,空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几秒（分）钟之内便耗竭，使溶氧成为限制因素,116,2.,发酵过程的溶氧变化,发酵初期，生产菌大量繁殖，需氧，溶氧下降,过了生长阶段，需氧减少，溶氧上升,发酵中后期，分批发酵的溶氧不变,生产后期，菌体衰老，溶氧上升,溶氧异常变化：,117,3.,溶氧浓度的控制,通气，搅拌,补料,118,（六）,CO2,的影响及控制,CO2,是微生物代谢产物，溶解在发酵液中的,CO2,对发酵有刺激或抑制作用,CO2,和,HCO3,影响膜的结构,CO2,使,PH,下降,影响菌体的呼吸速率等,CO2,对产物抑制，则降低浓度，对产物促进，则增加浓度,降低通气搅拌，则增加,CO2,在发酵液中溶解度,119,（七）发酵过程泡沫的形成与控制,发酵过程起泡的利弊：气体分散、增加气液接触面积，但过多的泡沫是有害的,泡沫产生的原因,（,1,）通气搅拌的强烈程度：,通气大、搅拌强烈可使泡沫增多，因此在发酵前期由于培养基营养成分消耗少，培养基成分丰富，易起泡。应先开小通气量，再逐步加大。搅拌转速也如此。也可在基础料中加入消泡剂。,120,（,2,）培养基配比与原料组成：,培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，前期难开搅拌,（,3,）菌种、种子质量和接种量：,菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量,（,4,）灭菌质量：,培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。,121,起泡的危害,1.,降低生产能力,：,在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装量,2.,引起原料浪费,：,如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费。,3.,影响菌的呼吸：,如果气泡稳定，不破碎，那么随着微生物的呼吸，气泡中充满,CO2,，而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响了菌的呼吸。,4.,染菌：,泡沫增多引起逃液，在排气管中粘上培养基，就会长菌。随时间延长，杂菌会长入发酵罐造成染菌。大量泡沫由罐顶进一步渗到轴封，轴封处的润滑油可起点消泡作用，从轴封处落下的泡沫往往引起杂菌污染。,122,消泡,机械消泡,消泡剂消泡：天然油脂，聚醚类消泡剂，高碳醇，硅酮类,123,（八）染菌的防治,发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤。,（,1,）污染噬菌体,噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被迫停产,。,124,（,2,）污染其它杂菌,有些杂菌会使生产菌,自溶,产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。,有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使,pH,下降,，使不耐酸的产品破坏。特别是染,芽孢杆菌,，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。,放线菌由于生长的最适,pH,为,7,左右，因此染细菌为多，而霉菌生长,pH,为,5,左右，因此染酵母菌为多。,125,青霉素发酵染菌,，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。,疫苗生产,危害很大。疫苗多采用深层培养，不加提纯而直接使用，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。,126,发酵前期染菌,发酵前期最易染菌，且危害最大。,原因,发酵前期菌量不很多，,与杂菌没有竞争优势,；,且还未合成产物（抗生素）或产生很少，,抵御杂菌能力弱。,在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。,染菌措施,可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调,pH,值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。,127,发酵中期染菌,发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液,pH,下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。,措施,降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。,128,发酵后期染菌,发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。,129,造成染菌的主要原因总结,1,、设备渗漏：,夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等,2,、空气带菌,3,、种子带菌,4,、灭菌不彻底,130,五、发酵终点的确定,考虑生产率和成本两个方面,由实验来确证,131,132,