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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。,第十七章 基因重组与基因工程,(genetic recombination and genetic engineer),1/76,1,基因重组,(genetic recombination),是指在体外用酶学方法将不一样起源DNA进行切割、连接，组成一个新DNA分子过程，又称,DNA重组,。,基因克隆,(gene cloning),将重组DNA分子导入到适当受体细胞中，使其扩增和繁殖，以取得大量同一DNA分子，称此为,基因克隆、DNA克隆或分子克隆,。,基因工程,(genetic engineering),是将不一样起源DNA片段与载体分子连接形成重组DNA分子，再导入宿主细胞内进行表示，也称,重组DNA技术,。,2/76,2,本章主要内容,主要工具酶,基因克隆惯用载体,重组DNA基本原理,重组技术在医学和制药,工业中应用,3/76,3,第一节 主要工具酶,工,具酶,基因工程中工具酶主要包含,用于,DNA,和,RNA,分子,切割、,连接,、,聚合、逆,转录,等,相关各种酶类。,4/76,4,一、限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease,RE),是一类由细菌产生能专一识别和,切割双链DNA,中特定碱基序列核酸内切酶，简称,限制酶,或,切割酶,。,依据限制酶作用特征，普通分为、和型，,其中惯用是,型限制酶,。,5/76,5,限制酶（型）识别及切割位点,特异识别及切割4,8个bp长度且含有,回文序列,DNA片断，主要产生3种末端结构：,5粘性末端,3粘性末端,平端或钝端,回文序列,(palindrome),是指该部位核苷酸序列呈180,O,反向重复;,粘性末端,(sticky end),是指经内切酶特异切割后产生5末端突出和3末端突出碱基序列相互间含有互补性,。,6/76,6,产生5-粘性末端,产生3-粘性末端,7/76,7,产生平(头末)端/钝端,其它特殊性质,型限制酶,同裂酶（,异源同工酶,）,同尾酶,可变酶,8/76,8,同裂酶,又称异源同工酶。指起源不一样，但含有,相同识别,序列,。,在切割DNA时，其,切割点,能够是,相同,，产生平头末端，称为,同识同切,；,切割点,也能够是,不一样,，产生3或5粘性末端，称为,同识异切,。,9/76,9,同裂酶,同识,同,切,10/76,10,同裂酶,同识,异,切,11/76,11,同 尾 酶,同尾酶,指起源不一样，但识别与切割次序有一定相关性一类酶。它们作用后,产生相同,粘性末端,。,12/76,12,可变酶,可变酶,识别次序中一个或几个碱基是可变，,而且识别次序往往超出6个碱基对。,如，,Bs,tp，其识别次序为GGTNACC。,13/76,13,惯用限制性核酸内切酶特征,微生物名称,酶名称,识别次序,同裂酶,同尾酶,Bacillus amyloliquefaciens,H,解淀粉芽孢杆菌,Bam,H,G,GATCC,Bst,Bgl,Mbo,Bacillius globigil,球芽孢杆菌,Bgl,A,CATCT,Escherichia coli,RY,13,大肠杆菌,Eco,R,G,AATTC,Haemophilus influenzae,流感嗜血菌,Hind,A,AGCTT,Hsu,Providencia stuartii,164,普罗威登细菌,Pst,CTGCA,G,Salp,Streptomyces albus,Subspecies pathocidicus,白色链球菌,Sal,G,TCGAC,Ava,Xho,14/76,14,限制性内切酶应用,经过切割不一样起源DNA双链特异碱基序列，,产生,含有黏性末端或平端、长度不一样DNA片段。,用于DNA重组、制备探针、分子杂交、DNA序列分析等。,15/76,15,二、DNA聚合酶,（,最惯用DNA聚合酶有以下4种,）,DNA聚合酶（全酶）,DNA聚合酶大片段Klenow片段,Taq DNA聚合酶,T,4,噬菌体DNA聚合酶,16/76,16,DNA聚合酶,E.Coli,DNA聚合酶（DNA pol）是一个含有,3 种酶活性多功效性酶。,包含：,5,3,DNA,聚合酶活性,5,3,核酸外切酶活性,3,5,核酸外切酶活性,17/76,17,DNA pol 应用,惯用来,催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA,探针,；,cDNA第二条链合成；,对DNA3,突出末端进行标识；,DNA序列分析。,18/76,18,E.coli,DNA pol.催化缺口平移,*,T,*,T,*,T,*,T,Mg,2+,D,N,a,s,e,I,5,3,3,5,3 5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,dATP,dCTP,dGTP,-,32,P dTTP,E.coli,DNA POL I,19/76,19,Klenow片段（DNA pol.大片断）,20/76,20,Klenow片段用途,补齐双链DNA,3末端；,用标识碱基补,齐3,末端；,用于,cDNA克隆中第二股链合成,；,DNA序列分析。,21/76,21,Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶）,作用特点,1）Taq DNA pol催化DNA合成最适温度范围,70,75，,2）95以上高温，半小时不失活，,3）最适适用于,聚合酶链反应（PCR）,。,22/76,22,三、逆转录酶,(reverse transcriptase),特点,逆转录酶是一个多功效性酶，最少含有以下3种酶,活性：,以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链,含有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中,RNA,以DNA为模板，,催化合成cDNA双链。,23/76,23,逆转录酶应用：,将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库,；,补平和标识5,-末端突出DNA片段；,代替Klenow酶用于DNA序列分析；,制备杂交探针等。,24/76,24,四、DNA连接酶,(DNA ligase),催化双链DNA中一条链3OH与另一条链5PO,3,H,2,形成磷酸二酯键，从而组成完整DNA长链。,DNA连接酶用途,（1）两个双链DNA片段连接起来,5-ACG AATTCGT-3,T,4,DNA连接酶,5-ACGAATTCGT-3,3-TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5,（2）修补带有缺口双链DNA分子,T,4,DNA连接,酶,25/76,25,五、碱性磷酸酶,（alkaline phosphatase）,能够催化水解去除DNA或RNA5-端磷酸基团。,用途,制备载体,时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5端磷酸基后，可预防载体本身环化连接，提升重组效率。,用,32,P标识5-端前，去除5-P，再经过激酶作用把放射性核苷酸加到,5-端进行标识,。,26/76,26,六、末端（脱氧核苷酸）转移酶(TdT),作用,将标识或未标识dNTP加到DNA3OH末端；也可催化载体分子或待克隆DNA片段上加上互补同聚尾，便于深入连接。,应用,探针标识,P,32,-,.,dGTP,G,32,G,32,G,32,G,32,G,32,G,32,G,32,G,32,在载体和待克隆片段上形成同聚物尾，方便于进行连接,3,3,27/76,27,主要工具酶,工具酶,活性,限制性核酸内切酶,识别特异碱基序列，切割DNA,T4 DNA连接酶,催化DNA5,-磷酸与3,-羟基,形成磷酸二酯键,DNA聚合酶,以DNA为模板合成DNA,逆转录酶,以RNA为模板合成cDNA,碱性磷酸酶,切除5,末端磷酸,T4多聚核苷酸激酶,催化核酸5-羟基磷酸化,末端脱氧核苷酸转移酶,催化3-端合成同聚尾,28/76,28,第二节 基因克隆惯用载体,载体,(vector),是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来，并运输到宿主细胞运载工具。其化学本质为DNA分子。,本节主要内容,载体必须具备基本条件,载体分类,惯用载体,29/76,29,一、载体必须具备基本条件,含有独立复制能力,具备多个限制酶识别位点(,多克隆位点,),含有,遗传表型或,筛选,标识,有,足够容量,以容纳外源DNA片段,可导入受体细胞。,30/76,30,二、载体分类,*,（一）,克隆载体,用来克隆和扩增DNA片段载体。,有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA三类,。,（二）,表示型载体,为了使插入外源DNA能够表示为多肽链而设计载体称为,表示型载体,。,表示型载体,除需载体必备条件外，还需对应,开启子、核糖体结合位点、增强子、终止子,等表示调控构件。,31/76,31,三、惯用载体,（一）质粒(plasmid)：,是存在于细菌染色体外、能自主复制双链环状DNA分子。,作为克隆载体质粒应具备以下特点：,1.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，,有较高拷贝数；,2.含有1个以上遗传标志，便于筛选；,3.含有多克隆位点。,32/76,32,总而言之，质粒载体应该是一个分子量较小、高拷贝“松弛型”质粒，且含有一个以上遗传标志和多克隆位点质粒。,广泛应用质粒：,pBR32质粒、pUC系列等,33/76,33,pBR322质粒,4363 bp,含一个复制点,含一个抗氨卞青霉素基因(,amp,R,),一个抗四环素基因 (,tet,R,),amp,R,和,tet,R,抗性基因内各有一些限制酶酶切位点，供外源基因插入,当外源基因插入抗药基因内后，抗药基因失活。,Amp,R,Amp敏感(,Amp,S,)、,Tet,R,Tet敏感(,Tet,S,).,34/76,34,pUC系列质粒,由pBR322和M13噬菌体构建而成双链质粒载体；,（1）2674bp；,（2）有,amp,R,和与M13噬菌体,相同多克隆位点（MCS）,（3）有1个来自E.coli,LacZ基因,片断,编码半乳糖苷酶，,便于蓝白筛选,35/76,35,(二)噬菌体,组成特点,：,双链线状DNA分子，,全长50kb，,含66个基因，,在其分子两端各含有12个碱基互补单链，是天然粘性末端，被称为,COS位点,。,36/76,36,噬菌体两种生长路径（示意图）,37/76,37,噬菌体感染细菌后,两种生长路径,溶菌性生长,噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补,成环,，在宿主菌体内,连续复制,，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，,裂解宿主菌,，释放出来噬菌体又可感染其它细菌。,溶源性生长,噬菌体感染细菌后，可将本身DNA,整合,到细菌染色体中去，与之,一起复制,，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。,38/76,38,第三节 重组DNA基本原理,（,DNA重组基本程序包含以下过程）,分,获取目标基因和载体,接,目标基因与载体连接,转,重组DNA导入宿主细胞,筛,重组DNA筛选与判定,39/76,39,一、目标基因获取（,分,）,目标基因,是指所要研究或应用基因，也是需要克隆或表示基因。,目标基因起源,1）制备基因组DNA,2）制备cDNA,3）聚合酶链反应,4）人工合成基因,40/76,40,（一）制备基因组DNA,（基因,文库，,genomic library,）,分离、纯化基因组DNA,在EDTA等存在下，用蛋白,RE,酶,K,消化细胞、酚抽提；,大小不一样酶切片段,惯用蔗糖梯度离心或电泳,分离酶切片断；,分别与一样RE酶切载体连接,惯用噬菌体载体或质粒载体,DNA连接酶连接；,导入宿主细胞、扩增,导入宿主细胞内培养、扩增；,得到分子克隆混合体,用分子杂交等方法进行判定、,（基因文库）,筛选、再扩增，分离、回收。,41/76,41,（二）制备cDNA,（cDNA文库）,分离目标基因,mRNA,逆转录生成cDNA单链,水解去除mRNA，,合成cDNA双链,水解回折处单链,得到平端双链cDNA,与载体连接，导入宿主细胞扩增,构建cDNA文库。,42/76,42,（三）聚合酶链反应(PCR),在体外，,以目标基因为模板，在DNA引物、dNTP、TaqDNA Pol等存在下，组成一个反应体系。经,94变性、54退火及72延伸,3个步骤重复屡次循环（25,30次,），扩增目标基因（见18章）。,（四）人工合成基因,应用DNA测序仪测出某一基因碱基序列，或依据某一蛋白质氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪经过化学合成原理合成目标基因。,（,普通先合成短片断DNA，然后再拼接成长片段,）,43/76,43,二、目标基因与载体连接（,接,）,（主要有以下4种连接方式）,1),粘性末端连接,2）,平头末端连接,3）,人工接头法,4）,同源多聚尾连接法,44/76,44,（一）粘性末端连接,将目标基因和载体用同一个限制酶酶切，产生,相同粘性末端，再经过DNA连接酶作用将二者连接起来，组成重组DNA分子。,（二）平头末端连接,有些限制酶只能将目标基因和载体DNA切割成,平端，此时在,T,4,DNA连接酶,作用下一样能连接起,来。,45/76,45,（三）人工接头法,合成,连接子,与DNA平头末端连接限制酶切割,产生粘性末端连接，构建重组DNA。,46/76,46,（四）同源多聚尾连接法,47/76,47,三、重组DNA导入宿主细胞（,转,）,无性繁殖,体外重组后DNA,导入,受体细胞,，然后随受体细胞生长、增殖，使重组DNA发生复制、扩增，这一过程称为无性繁殖。,克隆,从上述无性繁殖细胞中深入筛选出含目标DNA重组体分子即为无性繁殖系或克隆。,宿主细胞,进行无性繁殖时所采取受体细胞.,48/76,48,重组DNA,导入,宿主细胞,类型,转化,以,质粒,作载体构建重组体导入受体细胞过程；,转染,以病毒,作载体构建重组体导入受体细胞过程；,转导,以,噬菌体,作载体构建重组体导入受体细胞过程,。,感受态细胞,用特殊方法处理（CaCL,2,）后，受体细胞才具备接收外源DNA能力，这种细胞称,感受态细胞,。,感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。,49/76,49,四、重组DNA筛选与判定（,筛,）,（,筛选含重组体阳性菌落，普通有以下几个方法,）,1）平板筛选,2）限制酶切图谱筛选,3）PCR筛选重组体,4）原位杂交技术,插入失活,蓝白筛选,50/76,50,（一）平板筛选,是指利用载体遗传性标识在平板上直接筛选方法。,含有抗药性标识载体，转化宿主细胞后，能,在含抗生素（Amp或Tet）培养平板上生长；未转,化则不能生长。,插入失活,当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使,该基因失活，转化细胞就不能生长在含对应抗生素,培养平板上。,51/76,51,抗生素平板筛选,（,插入失活,）,52/76,52,2.,蓝,-,白,筛选,利用蓝色化合物形成作为,指示剂,，筛选带重组质粒细菌。,载体：,编码-半乳糖,宿主：,编码-半乳糖,苷酶,N端,序列,苷酶,C端,序列,-互补,细菌表示：,-半乳糖苷酶活性,5-溴-4-氯-3-吲哚（,X-gal,）,形成,蓝色菌落,当在质粒中,插入外源DNA,-半乳糖苷酶N端基因失活,不能与宿主,-半乳糖苷酶C端,进行-互补,产生,白色菌落,。,（IPTG 存在下）,53/76,53,蓝,白,筛选,示意图,54/76,54,(二)限制性内切酶图谱判定,55/76,55,（三）PCR筛选重组体,抽提少许重组DNA,PCR扩增,电泳判定,序列分析。,（四）原位杂交技术,56/76,56,1、获取,DNA重组基本过程(小结),57/76,57,2、重组,58/76,58,3、转化,体,59/76,59,4、筛选,60/76,60,5、克隆,61/76,61,6、表示,表示产物分离纯化,62/76,62,五、重组体在宿主细胞中表示和调控,基因工程最终目标是经过载体将外源基因导入适当宿主细胞中高效表示，产生有主要价值蛋白质产品。,克隆基因表示有三个条件,基因编码区不能被插入序列中止;基因转录要有开启子，而开启子必须能被宿主 细胞RNA聚合酶有效地识别;mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生外 源蛋白质必须不为宿主细胞蛋白酶所降解。,63/76,63,第四节 重组技术在医学和制药工业中应用,一、疾病基因发觉,1990年,美国科学家率先开启,人类基因组计划（HGP），,计划历时15年，至年完成；,年2月12日,由Since和Nature杂志同时向世界宣告，人类基因组3X10,9,bp最新图谱，约含3,4万个基因；,整个人类基因组全部核苷酸序列很快即将完成。,但要揭示人类4万个基因功效任务将更为艰巨。,64/76,64,人类基因组图谱初步完成，不但为全部基因定位建立了一个开放框架，而且为分离、判定人类疾病相关基因提供了参考模板。,如已知人类遗传性疾病约有3000种，推测可能是因为一些基因结构异常或基因位移等突变所致。假如,利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常基因图谱作对照分析,，必将有利于说明遗传病分子机制，这对遗传病基因治疗将起到不可估量推进作用。,65/76,65,产品名称,治疗功效与医药范围,1.,人胰岛素,治疗糖尿病,2.人生长激素,治疗侏儒症，加速创口愈合,3.干扰素,治疗癌症、病毒感染,4.干扰素,治疗带状疱疹，眼结、角膜炎,5.干扰素,治疗癌症、病毒感染,6.人组织纤溶酶原激活因子(tPA),溶解血栓，治疗急性心肌梗塞,7.红细胞生成素(Epo),治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平,8.超氧化物歧化酶,去除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死,9.凝血因子,治疗A型血友病,10.乙型肝炎疫苗,防治肝炎,11.神经生长因子,维持神经元细胞存活、生长和分化,12.脑啡肤,镇痛,13.降钙素,治疗骨质疏松症,二、生产蛋白质和多肽类活性物质,66/76,66,基因工程生产胰岛素原理（示意图）,67/76,67,三、制备基因工程疫苗,基因工程疫苗能够帮助处理传统技术难以处理,一些特殊病原体疫苗。,如,，,（1）乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫,苗（HCV）等；,（2）有诱发致癌或产生免疫病理作用疫苗，如人,T细胞免疫缺点病毒（HITV-1）等；,（3）常规效果较差疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等,（4）制备一些多价疫苗等。,68/76,68,四、改良物种特征,69/76,69,动物药厂,经过转基因动物生产感兴趣基因,把YFG放在乳球蛋白开启子下,注入羊卵细胞植入借腹怀孕母羊体内,YFG在乳腺中表示,乳汁中提纯YFG蛋白。,70/76,70,1.分离体细胞,（先处于“饥饿”“静止状态”）使“关闭”基因全部“打开”。,2.植入去核卵细胞中胚胎细胞,3.将胚胎细胞植入寄养母体内。,五、动物克隆,71/76,71,六、其它应用,（略）,72/76,72,基因重组和基因工程（课堂练习）,基因工程中惯用限制性内切酶是,A.,型限制酶 B.型限制酶,型限制酶 D.核酸内切酶,核酸外切酶,催化DNA缺口平移反应酶是,末端转移酶 B.DNA聚合酶,DNA聚合酶 D.DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶,73/76,73,Klenow片断含有以下酶活性,A.53外切酶和 53聚合酶活性,53 和35外切酶活性,C.53聚合酶 和35外切酶活性,53 和35聚合酶活性,E.53 外切酶和35聚合酶活性,碱性磷酸酶作用是,A.使核酸片段3端加上磷酸基,B.去除核酸片段3端磷酸基,去除核酸片段5端磷酸基,D.使核酸片段5端加上磷酸基,E.使核酸链水解断裂,74/76,74,以下是关于基因克隆惯用载体叙述，正确是,在连接酶作用下，载体可与目标DNA连接组成重组体,载体是将目标DNA引入宿主细胞运载蛋白,载体是将目标DNA引入宿主细胞DNA分子,惯用载体有质粒、噬菌体和病毒等,载体可将目标DNA运载入宿主细胞内而本身不进入细胞,DNA重组应包含以下过程,分离并取得目标基因和载体,B.连接目标基因和载体组成重组体,将重组体导入宿主细胞内,从转化菌落中筛选并判定含阳性重组体菌落,E.以上都包含,75/76,75,目标DNA可来自,直接从组织中提取 B.基因文库,cDNA文库 D.PCR扩增,E.DNA合成仪合成,目标DNA与载体连接方法可有,粘性末端连接 B.平头末端连接,同源多聚尾连接 D.人工接头法,E.载体分子本身环化连接,76/76,76,
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