中药指纹图谱研究技术(中华中医药学会).ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,中药指纹图谱,研究技术,中华中医药学会中药化学分会委员,周玉新,1,内 容,一、中药指纹图谱技术概述,二、中药指纹图谱研究指导原则,三、指纹图谱研究的相似度计算,四、中药指纹图谱的研究方法与思路,五、中药指纹图谱研究示例演示（实验）,2,一、中药指纹图谱技术概述,3,（一）中药指纹图谱与中药质量,（二）中药指纹图谱研究方法学,（三）中药指纹图谱技术的发展,4,指 纹 图 谱,稳 定 性,可 控 性,安 全 性,有 效 性,1.中药指纹图谱与中药安全、有效、稳定的关系,（一）中药指纹图谱与中药质量,5,2.国内中药质量评价现状,植物学方法：,原植物鉴定，显微鉴定等,植物化学方法：,理化鉴定,分析化学方法：,仪器分析，色谱分析等,药理学方法：,生物鉴定法，生物等效等,分子生物学方法:,DNA指纹鉴定,6,3.国外植物药质量评价概况,标准制剂,：,银杏 人参 西洋参 五味子,甘草 黄芪 贯叶连翘,定量测定结合主成分比例,固定产地以生产质量恒定制剂,多种分析手段和方法包括药材、中间体等指纹图谱,7,4.中药指纹图谱的意义,是全面反应中药所含内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量，尤其在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量和稳定性,有利于中药及其产品进入国际市场,8,5.中药指纹图谱建立的原则,系统性：,指纹图谱所反映的化学成分，应包括中药有效部位,所含大部成分的种类，或指标成分的全部,特征性：,指纹图谱中反映的化学成分信息（具体 表现为保留,时间或位移值）是具有高度选择性的，是这些信息,的综合结果,稳定性：,指纹图谱在规定的方法与条件下应能作出相对一致,的指纹图谱,色谱特征的稳定性：特征峰,特征区 特征参数,色谱条件稳定性：不同仪器的验证 不同实验室的验证,不同操作者的验证,9,品种鉴别,-,真伪,基源鉴别,-,产地,药用部位的鉴别,-,根,、,茎,、,叶,、,花,、,果,提取工艺,药材炮制,限量成分的控制,一致性,-,不同批次的产品,.,6.指纹图谱研究目的,10,品种多,、产地多;,采收,、,加工不一致,化学组分与含量不同,（产品品质优劣不同）,有效组分种类繁多,、含量相对少,；非有效组分成,分复杂,、,含量高,分析检测困难,（质量控制指标不统一）,基础研究薄弱,药材GAP建设滞后,7.建立中药指纹谱所面临的问题,11,8.对 策,加强GAP药材种植基地建设,加强中药种植与加工、炮制的规范化,加强中药化学成分的基础研究,应用现代分析技术手段进行中药指纹图谱研究,12,仪 器 设 备,技 术 人 员,研 究 经 验,系统性问题,稳定性问题,特征性问题,9.中药指纹谱研究过程中面临的问题,13,色谱法,1.液相色谱法（LC）,2.气相色谱法（GC）,3.薄层扫描法（TLC）,4.毛细管电泳法（CE）,其它,1.质谱法（MS）及色谱与质谱联用,2.X-衍射法,3.近红外法（NIR）等,（二）中药指纹图谱研究方法学,14,（三）中药指纹图谱技术的发展,应用范围,仪器设备与软件,指纹图谱标准,15,二、中药指纹图谱研究指导原则,16,（一）目的和要求,（二）中药指纹图谱标准起草说明,（三）中药指纹图谱标准的建立,17,中药质量研究和质量标准的一个重要内容,加强中药质量管理、提高中药质量、保证药品安全、有效、稳定、可控,固定原料药（中药材）品种、产地和采收季节的前提下，需制定原料药(中药材)和注射剂的指纹图谱,（一）目的和要求,18,（二）中药指纹图谱标准起草说明,1.名称、汉语拼音,2.来源（产地、采收期、炮制）,按中药的命名原则制定,药 材：产地、采收期、炮制,中间体：提取工艺或提取物的来源,19,3.供试品溶液的制备,有效成分(专属性成分、指标性成分)的理化性投,质并结合检测方法的要求,提取工艺,参照物溶液的制备,对照品,内标物,标准提取物,20,中药指纹图谱检测方法的验证,（1）检测方法,测定方法、仪器 、试剂 、测定条件,（2）验证,专属性（空白试验）,精密度试验（RSD3%）,重复性与重现性试验（S0.95）,稳定性试验（S0.95）,系统适应性试验,6.指纹图谱的相关性,21,（三）中药指纹图谱标准的建立,22,注意事项,（1）所有成分应在2小时左右洗脱，并提供2小时的指纹图谱,（2）可建立各个组分的指纹图谱,（3）可建立多种方法的指纹图谱,（4）可选择典型样品的指纹图谱，或标准提取物的指纹图谱，,或具有代表性的勾兑样品的指纹图谱作为标准指纹图谱,23,2.指纹图谱标准的建立,（1）药材、中间体指纹图谱标准为企业内控标准，列入,起草说明,（2）10批供试品,（3）标准的规定：,供试品的指纹图谱与对照提取物（标准提取物的指纹图谱一致；或供试品的指纹图谱与对照指纹图谱（标准图谱）一致；或通过对各特征峰的位置（相对保留时间、比移值等）、丰度（积分面积或峰高）及相对丰度、光谱特性（颜色）等综合参数的描述予以确定。,24,指纹图谱标准书写格式,液相色谱法,【指纹图谱】照高效液色谱法（中国药典一部附录VI D），结合指纹图谱的要求测定。,色谱条件及系统适用性试验 如以对照品做系统适用性试验，则参照中国药典书写格式。如以随行对照提取物做系统适用性试验，则只书写所用仪器、色谱柱型号及有关参数和各项具体试验条件。,对照品溶液的制备 如有对照品则照中国药典书写格式。,供试品溶液的制备 精密吸取供试品溶液、对照品溶液（或对照用提取物溶液）各 XX,m,l，分别流入液相色谱仪，测定。,本品指纹图谱的主要特征 供试品指纹图谱与质量标准所附的对照指纹图谱（或随行对照提取物指纹图谱）经计算软件计算，相似度大于 XX，符合要求（或相似度小于 XX，不符合要求）。,25,三、指纹图谱研究的相似度计算,26,（一）、指纹图谱相似度评价原则与方法,（二）、指纹图谱相似度计算原理,（三）、指纹图谱相似度评价软件,27,（一）、指纹图谱相似度评价原则与方法,原则：,整体性、模糊性、特征性,方法：,直接观察、计算机辅助相似性计算,28,1.引用参数,2.数据获取途径,3.相似度算法,（二）、指纹图谱相似度计算原理,29,1.引 用 参 数,保留时间(RT),峰高(Height),峰面积(Area),峰面积百分比（Area%）,相对保留时间（Ratio of Retention Time,R,Rt,）,积分相对比值（Ratio of Area,R,A,）,30,2.数 据 获 取 途 径,（1）图形/图像转化成ASCII数据,（2）截片数据,（3）色谱数据,31,3.相 似 度 算 法,夹角余弦算法,相关系数算法,优 化 算 法,32,1.软件开发原则,2.市售/常用软件简介,3.相似度软件使用过程中应注意的问题,（三）、指纹图谱相似度评价软件,33,1.软 件 开 发 原 则,系统独立性,(2)计算方法的科学性,(3)数据接口通用性,(4)操作过程及应用的实用性,34,2.市售/常用软件简介,浙江大学 陈一宇教授,中南大学 梁逸增教授,沈阳药科大学 毕开顺教授,西北大学 李华教授,二军大,Waters,35,3.相似度软件使用过程中应注意的问题,数据接口与数据类型,数据的校正,算法的选择,36,四、中药指纹图谱的研究方法与思路,37,（一）、研究方案设计,（二）、样品的选择与收集,（三）、供试品的制备,（四）、指纹图谱色谱条件研究的思路,（五）、相似度值的研究与指纹特征,38,（一）、研究方案设计,资料收集与整理,文献、工艺资料、质量标准,方案的设计,（1）研究对象-有效成分,（2）研究方法的选择-色谱法(HPLC GC TLC)及其它方法,（3）研究内容-根据技术要求的规定：包括,“,名称、来源、制备、检测方法、标准规定及起草说明,”,39,（二）、样品的选择与收集,要求：,10个批次,道地药材与GAP基地药材,典型性与代表性,离散样品的剔除,40,（三）、供试品的制备,依据：,有效组分的物理化学性质,生产或提取工艺,检测方法的需要,41,（四）、指纹图谱色谱条件研究的思路,高效液相色谱法 HPLC,气相色谱法 GC,42,（1）检测波长的选择,（简）,（2）柱温的选择,（略）,（3）进样量,（简）,（4）色谱柱的选择,（重点）,（5）检测成分的选择,（重点）,（6）流动相（梯度表）的选择,（重点）,1.高 效 液 相 色 谱 法 HPLC,43,示例：蜂胶(Bee Propolis),（1）检测波长的选择,44,=,280nm,=,360nm,=,254nm,=,210nm,45,波长选择：,=,280nm,46,（4）色谱柱的选择,选用市场上较常见的填料所填充的色谱柱，例如：Eka-Nobel的Kromasi C18(5,m,m)，其分离效果好、性能稳定，无论是国产填充的Kromasi色谱柱，还是国外公司填充的Kromasi色谱柱，在分离效果上基本相同。因此对于大多数中药注射剂，可选用Kromasi色谱柱。,如选用乙腈-缓冲溶液，应根据缓冲溶液的特点，选用相应的色谱柱：如为酸性缓冲溶液，可选用Zorbax SB-C18色谱柱（pH6）。,示例：不同的色谱柱对三七总皂苷的分离效果,47,Lichosorb,48,Polaris,49,Kromasil,50,Diamonsil,51,Carbosorb,52,53,（5）检测成分的选择,（重点）,示例：何首乌,54,何首乌生品的液相色谱图（全局图）,55,何首乌生品的液相色谱图（局部放大图）,56,57,58,59,60,61,62,图9 上海制首乌指纹图谱,北京良方药业制首乌,63,北京金象药店制首乌,北京寿春堂药店制首乌指纹图谱,64,（6）流动相（梯度表）的选择,主要影响因素,1.起始浓度,2.梯度速率,3.流速,65,时间min,水%（H,+,/OH,-,）,*,乙腈%,*,0,100,0,55,20,80,60,0,100,0,100,0,40,70,30,60,60,40,0,80,20,40,60,40,60,50,50,0,60,40,40,30,70,60,0,100,*,为体积百分比（V/V）,指纹图谱流动相梯度优化,*,为体积百分比（,V/V,）,梯 度 表,66,初始色谱条件,时间（min）,水%（H,+,/OH,-,）,乙腈%,0,100,0,60,0,100,时间（min）,水%（H,+,/OH,-,）,乙腈%,0,100,0,55,20,80,60,0,100,67,初始色谱条件的设定依据及目的,依据：化合物极性大小。如未知时，假设有效组分中包含各种极性的成分。,目的：快速确定主要或大部分化合物被洗脱时流动相的组成，为优化条件的选择提供依据。,68,优化条件的选择,选择依据：初始色谱图、梯度洗脱表及一定的经验,示 例：（1）淫羊藿总黄酮（40%）提取物,（2）钩藤总生物碱,（3）黄连药材,（4）知母总皂苷,69,淫羊藿提取物在初始条件下的色谱图,70,淫羊藿提取物第一次优化后的色谱图,71,梯度速率：,初始：100/60min=1.7/min,优化：01.7,72,CH,3,CN%,CH,3,CN%,Min,Min,初始条件,73,CH,3,CN%,Min,三七 人参 西洋参,CH,3,CN%,Min,74,起始浓度：根据初始色谱图中主要色谱峰被,洗脱时的流动相组成，相应减少,20%。,流 速：0.52.0 ml/min,75,2.气 相 色 谱 法,（1）影响色谱峰分离程度的因素,色谱柱的类型,载气流速,起始柱温,升温速率,76,（2）研究示例,样品：广藿香油指纹图谱研究过程,方案设计,77,检测方法,（1）色谱方法,广藿香油为广藿香药材经水蒸汽蒸馏而得到的挥发油，均为易挥发组分，拟采用,气相色谱法,（,GC,）。,（2）仪器：,Agilent 6890 GC,（3）色谱柱的选择,可供选择的色谱柱：极性,非极性,中等极性,（4）进样方式的确定,手动,自动 顶空,78,2.供试品溶液的制备,取广藿香油适量，加醋酸乙酯溶解，即得。,注：对于非极性毛细管色谱柱，如供试品溶液中含少量的少，最好干燥后进样。,79,2.色谱条件的摸索,（1）对梯度速率及流速进行微调-由粗到精,80,初始条件,流 速：3.0 ml/min,进样口温度：250,检测口温度：280,初 始 柱 温：50,升温 速 率,：30,/min,81,第一次优化,流 速：2.0 ml/min,进样口温度：250,检测口温度：280,初 始 柱 温：50,升温 速 率,：20,/min,82,第二次优化,流 速：1.0 ml/min,进样口温度：250,检测口温度：280,初 始 柱 温：50,升温 速 率,：10,/min,83,第三次优化,流 速：1.0 ml/min,进样口温度：250,检测口温度：280,初 始 柱 温：50,升温 速 率,：5,/min,84,第四次优化,流 速：0.5 ml/min,进样口温度：250,检测口温度：280,初 始 柱 温：50,升温 速 率,：5,/min,85,（2）选择细化的初始条件-由细到精,86,初始条件,流 速：1.0 ml/min,进样口温度：250,检测口温度：280,初 始 柱 温：50,升温 速 率,：1.0,/min,87,第一次优化,流 速：1.0 ml/min,进样口温度：250,检测口温度：280,初 始 柱 温：150,升温 速 率,：1,/min,88,（3）根据初始条件（由粗到精）下的色谱图，计算,大多数色谱峰出峰时的柱温范围，确定第一次,优化时柱温的梯度变化范围。,89,初始条件,结果：,RT=7min后，基本没有色谱峰；RT=8min后，基线平直。,主要色谱峰被洗脱时的RT：4min7min,主要色谱峰被洗脱时的柱温范围：170250,90,第一次优化,流 速：1.0 ml/min,进样口温度：250,检测口温度：280,初 始 柱 温：100,升温 速 率,：5,/min,91,第二次优化,流 速：0.5 ml/min,进样口温度：250,检测口温度：280,初 始 柱 温：100,升温 速 率,：5,/min,92,结 论,对本供试品中的组分的分离，升温速率是主要影响因素，载气（N,2,）的流速是次要因素。,本供试品中的挥发性组分，其沸点相对较高，故应相应提高初始柱温的设置值。,载气（N,2,）的流速的调整可改善色谱峰的分离。,注意的问题,条件优化的目的：,应尽可能使每个色谱峰为单一色谱峰,保证大多数峰及/或含量较高的成分达到基线分离。,初始柱温的设置,梯度变化的速率,保留时间 最佳,30min,溶剂空白,93,1.注意的问题,溶剂色谱峰-色谱纯试剂,杂质（敷料）色谱峰-分离提取,相似度值的计算,3.指纹特征,特征指纹峰与特征指纹区,（五）、相似度值的研究与指纹特征,94,指纹图谱研究过程中的复杂样品的选择,有效组分的复方制剂,西洋参与淫羊藿,95,