酵母单杂交实验步骤总结.doc

1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）
注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAir报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。
（1） 设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。
（2） 用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 mmol/L。
（3） 将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 mmol/L）。
（4） 95 °C保温30 s，去除二级结构。
（5） 72 °C保温2 min，37 °C保温2 min，25 °C保温2min。
注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。
（6） 冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 °C冰箱备用。
（7） 酶切1 mL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。
注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。
（8） 将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 mmol/L。
（9） 在连接反应管中加入如下成分：
pAbAi载体（50 ng/mL） 1.0 mL
annealed oligonucleotide （0.5 mmol/L） 1.0 mL
10×T4 DNA ligase buffer 1.5 mL
BSA（10 mg/mL） 0.5 mL
Nuclease-free H2O 10.5 mL
T4 DNA ligase （400 U/mL） 0.5 mL
总体积 15 mL
注：如果有必要，可用1 mL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。
（10） 将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。
注：可用酶切或测序进行检测。
2 质粒转化酵母细胞，生成Bait-Reporter酵母菌株（图）

图3 Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意图
（1） 用BstB I或者Bbs I酶切2 mL pBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi质粒，使其在URA3基因处断开，纯化酶切产物。
（2） 按Matchmaker Yeast Transformation System 2的步骤用1 ml酶切后的质粒转化Y1HGold酵母。
（3） 稀释每个转化体系至1/10、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于SD/-Ura琼脂平板上。3 d后挑取5个单克隆，用Matchmaker Insert Check PCR Mix1进行PCR检测阳性克隆，用Y1HGold的单克隆做阴性对照。
（4） 在PCR管中加25 ml PCR-grade H2O。
（5） 用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。将枪头伸进PCR-grade H2O中搅拌，使酵母细胞散开。
注：切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止PCR反应的进行。如果加入细胞后水变浑浊，证明加入了过多的酵母细胞。
（6） 向每个管中加入25 ml Matchmaker Insert Check PCR Mix，混匀，离心。每个PCR管中现已含有如下反应物：
Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 ml
H2O/yeast 25 ml
总体积 50 ml

（7） 按下述程序进行PCR反应；
95 °C 1 min
98 °C 10 s
55 °C 30 s 30 cycles
68 °C 2 min

（8） 取5 ml PCR产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析。
注：引物与AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因组结合，扩增片段长约1.4 kb。

图4 PCR检测pBait-AbAi的插入情况
正确的PCR检测结果应是：
阳性对照：1.4 kb
阴性对照：无条带
诱饵菌株：1.35 kb+insert size

（9） 分别挑取PCR检测呈阳性的诱饵克隆和p53-AbAi对照克隆，在SD/-Ura平板上划线培养。30 °C孵育3 d后，将平板置于4 °C保存，即为新构建的Y1HGold[Bait/AbAi]菌株和[p53/AbAi]对照菌株。
（10） 经过长期放置后，挑取单克隆在YPDA液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，用 1 mL预冷培养基（100 ml灭菌的YPDA与50 ml灭菌的75%甘油混合）重悬菌体，速冻后与-70 °C保存。

3 检测诱饵菌株AbAr基因的表达
在不存在捕获物的情况下，由于克隆到pAbAi载体中的诱饵序列不同，诱饵菌株报告基因的本底表达水平也不相同。例如：p53-AbAi对照的最低aureobasidin A抑制浓度为100 ng/ml。
注：酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与目的序列结合或者结合能力非常弱。因此在进行文库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株AbAr基因的表达情况十分重要。所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑制诱饵菌株报告基因本底表达所需的AbA浓度。

（1） 分别挑取诱饵克隆和对照克隆，用0.9% NaCl重悬细胞，调节A600到0.002（大约2000个细胞/100 ml）。
（2） 在下述培养基上分别涂布100 ml重悬后的菌液，30 °C培养2-3 d。
SD/-Ura
SD/-Ura with AbA （100 ng/mL）
SD/-Ura with AbA （150 ng/mL）
SD/-Ura with AbA （200 ng/mL）
预期结果如下所示：
表1 AbAr基因预期本底表达结果
[AbA]/（ng/mL）
Y1HGold[p53-AbAi]克隆数
Y1HGold[pBait-AbAi]克隆数
0
约2000
约2000
100
0
Bait dependent
150
0
Bait dependent
200
0
Bait dependent

（3） 在进行文库筛选时，使用AbA的浓度应为最低抑制浓度，或使用比最低抑制浓度稍高的AbA浓度（高约50-100 ng/mL），以彻底抑制诱饵菌株的生长。
注：如果200 ng/mL AbA不能抑制本底表达，可以尝试提高AbA浓度至500-1000 ng/mL。然而，在不存在捕获物的情况下，如果1000 ng/mL的AbA浓度仍无法抑制AbAr基因的表达，那么很可能存在能够识别并与目的序列结合的内源调控因子，因而该目的序列无法用来进行酵母单杂交筛选。

4 文库cDNA的合成
提取试材总RNA，进行反转录合成cDNA。合成的cDNA末端具有与pGADT7-Rec相同的酶切位点。

（1） cDNA第一链的合成
①准备高质量的poly A和/或总RNA，用human placenta poly A+RNA作为阳性对照。
注：RNA的质量决定文库的质量，RNA应为所要研究的特定时期和特定组织的RNA。

②在微量离心管中加入如下反应物：
RNA模板（0.025-1.0 mg poly A和/或0.10-2.0 mg总RNA） 1-2 ml
CDS III（oligo-dT）or CDS III/6（random）引物 1.0 ml
Deionized H2O （使总体积达到4.0 ml） 1-2 ml
总体积 4.0 ml
在另外一支管中加入对照cDNA反应物，即RNA使用1 ml（1 mg）control poly A+RNA。

③72 °C孵育2 min。

④冰上放置2 min，轻轻混匀，立即加入步骤⑤中的试剂。

⑤每一个反应加入如下试剂，轻轻混匀离心。
5×first-strand buffer 2.0 ml
DTT（100 mmol/L） 1.0 ml
dNTP mixture（10 mmol/L） 1.0 ml
SMART M-MLV RT 1.0 ml
总体积 5.0 ml
注：步骤⑤中的试剂可在步骤②之前加好置于冰上。此步是cDNA合成的起始关键步骤，变性后的RNA/引物mix冰上放置的时间不应超过2 min。

⑥如果用的是CDS III/6随机引物，25-30 °C保温10 min。如果用的是CDS III引物，省略此步，进行步骤⑦。

⑦42 °C保温10 min。

⑧加入1 ml SMART III oligo，充分混合，42 °C保温1 h。

⑨75 °C保温10 min终止第一链的合成。

⑩降至室温，加入1 ml RNase H（2 U）。

11 37 °C保温20 min。

12 cDNA第一链合成产物应于-20 °C保存，可用3个月。

（2）long distance PCR （LD-PCR）合成cDNA 第二链
根据合成cDNA第一链时使用的RNA量，下表给出了进行LD-PCR时最佳的热循环数。使用的热循环数越少，非特异性PCR产物越少。
表2 RNA量与最佳热循环数
总RNA/mg
Poly A+RNA/mg
循环数
1.0-2.0
0.5-1.0
15-20
0.5-1.0
0.25-0.5
20-22
0.25-0.5
0.125-0.25
22-24
0.05-0.25
0.025-0.125
24-26

⑴LD-PCR反应混合物中加入如下物质（每个样品做2个100 ml体系，对照做1个100 ml体系）：
First-strand cDNA （from protocol A） 2 ml
Deionized H2O 70 ml
10×advantage 2 PCR buffer 10 ml
50×dNTP mix 2 ml
5’RACE引物 2 ml
3’RACE引物 2 ml
Melting solution 10 ml
50×advantage 2 polymerase mix 2 ml
总体积 100 ml

⑵按照以下程序进行PCR反应：
1个循环 95 °C 30 s
X个循环 95 °C 10 s
68 °C 6 min
1个循环 68 °C 5 min

⑶取7 ml PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶检测，检测时使用1 kb DNA ladder。

（2） 使用CHROMA SPIN+TE-400柱纯化ds cDNA
⑴为每一个要纯化的cDNA样品准备一个CHROMA SPIN+TE-400柱。

⑵将纯化柱翻转几次，充分悬浮gel matrix。

⑶移去柱的顶盖和底盖，将柱放入2 ml收集管中。

⑷将柱放入离心机，700 g离心5 min以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。

⑸将柱放入新的收集管中，把cDNA加到gel matrix的中央，切勿使样品沿柱的内壁流下。
注：加到边上易使样品沿柱内壁流下，易混有小片段cDNA。

⑹700 g离心5 min，纯化的cDNA收集到管中。

⑺将两个纯化的cDNA样品合并到一管，测量体积。

⑻加入1/10体积3 mol/L醋酸钠（pH5.3），混匀。

⑼加入2.5倍体积无水乙醇。

⑽-20 °C冰冻1 h。

⑾室温，14000 r/min离心20 min。

⑿小心弃去上清液，切勿碰到沉淀。

⒀14000 r/min瞬时离心，去除残留上清液。

⒁沉淀于空气中干燥10 min。
注：一般干燥至无乙醇味，不可过度干燥，否则很难溶解。

⒂用20 ml灭菌去离子水溶解沉淀，此cDNA可用来进行同源重组构建文库。纯化后的cDNA用1%的琼脂糖电泳检测。

5 构建并筛选酵母单杂交文库（cDNA融合表达文库的构建及筛选）
（1） 构建并在SD/-Leu/AbA培养基上检测Y1HGold[Bait/AbAi]菌株。
注：AbA的浓度根据构建诱饵载体时转入酵母抑制本底表达时的浓度而定。
（2） 按SMART technology步骤合成ds cDNA，其浓度为2-5 mg/20 mL。
（3） 用Yeast Transformation System 2的方法转化酵母，在转化体系中加入如下物质：
①cDNA文库转化Y1HGold[Bait/AbAi]菌株
20 ml SMART-amplified ds cDNA （2-5 mg）
6 ml pGADT7-Rec，（Sma I-linearized）（3 mg）
②Y1HGold [53/AbAi]的转化
5 ml p53 fragment （125 mg）
2 ml pGADT7-Rec，（SmaI-linearized）（1 mg）
将转化体系分别稀释至1/10、1/100、1/1000、1/10000后，各取100 ml涂100 mm平板。
文库转化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA平板，对照p53转化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200平板。

（4） 将剩余的所有文库转化混合物（约15 ml）涂在150 mm SD/-Leu/AbA平板上，每板涂150 ml。
（5） 倒置培养3-5 d。
（6） 3-5 d后，通过统计SD/-Leu 100 mm平板上的克隆数目来计算筛选的克隆数。
注：所筛选的克隆数至少应该达到1百万，否则会降低筛选到目的产物的可能性。
筛选的克隆数=[cfu/ml on SD/-Leu]×[dilution factor]×[resuspension volume（15ml）]
例如：resuspension volume=15 ml
Plating volume=100 ml
250 colonies grew on the 1/100 dilution on SD/-Leu plates
The number of clones screened=250 cfu/0.1 ml×100×15 ml=3.75 million

（7） 预期结果
阳性对照试验：SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200培养基上的克隆数相近。
文库筛选试验：根据SD/-Leu平板上的克隆数计算所筛选的克隆数，其结果应大于1百万且SD/-Leu/AbA平板上的克隆数远远少于1百万，阳性克隆数目取决于诱饵序列。

6 阳性克隆的鉴定及cDNA质粒的分离
（1） 阳性克隆重新划线培养，进行表型确认
①将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重新划线，产生新的单克隆。

②2-4 d后，选择能够正常生长的克隆进行后续分析。

（2） 酵母克隆PCR消除重复克隆
①用Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 （Cat.No.630497）进行PCR，对插入到pGADT7载体中的cDNA片段进行扩增。PCR管中加入以下反应物：
Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 ml
H2O/Yeast 25 ml
总体积 50 ml

②按下述程序进行PCR反应：
94 °C 1 min
98 °C 10 s
68 °C 3 min

③PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。产物不是单一的条带很正常，这表明在同一酵母细胞不存在一种捕获载体
注：为了确认大小相近的条带是否是同一种插入片段，用Alu I或Hae III或者其它常用的限制性内切酶消化PCR产物，产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。

④如果大量的克隆含有同一插入片段，则另取50个克隆进行PCR分析。

⑤为了快速验证克隆，PCR产物可经过纯化后用T7引物测序。

（3） 阳性cDNA质粒的分离获取
①酵母中文库质粒的分开。
与转化的大肠杆菌不同，转化的酵母细胞可以含多种相关质粒，这就意味着阳性克隆里不只含有能激活AbAr报告基因的质粒，还可能含有一种或多种不表达相互作用蛋白的cDNA质粒。如果不事先将非互作质粒分开出去而直接通过转化大肠杆菌获取质粒，那么很有可能获取到非相互作用的质粒。为了增加获取阳性克隆捕获质粒的几率，可以将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重复涂布2-3次，每次都挑取单一的克隆进行下一步涂布。

②从酵母中获取阳性cDNA质粒
为了鉴定阳性互作相关的基因，用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit （Cat.No.630467）从酵母中获取阳性质粒。

③转化E coli并分离阳性cDNA质粒
用常用的克隆菌株对阳性cDNA质粒进行克隆，用LB加100 g/ml ampicillin进行选择。

（4） 鉴别阳性和假阳性互作
酵母单杂交筛选可能会检测到假阳性，用以下标准可以区分阳性和假阳性
阳性：正确的诱饵序列和捕获物都是激活AbAr报告基因所必需的。
假阳性：在诱饵序列突变的情况下，诱饵仍可以激活AbAr报告基因。
用下述程序在选择培养基上对阳性和假阳性相互作用进行确认：
①用Yeastmaker Transformation System 2的试剂和small-scale转化程序将100 ng获取的捕获质粒转化到Y1HGold[Bait/AbAi]和Y1HGold[Mutant/AbAi]菌株中。
注：阳性对照和阴性对照实验应该一起进行。

②在SD/-Leu和SD/-Leu/AbA培养基上涂100 ml转化混合物1/10和1/100的稀释物。

③30 °C恒温培养3-5 d后，预期结果如表所示。

表3 阳性和假阳性相互作用验证结果
A 阳性
样品
选择培养基
2 mm清晰的克隆
酵母菌
SD/-Leu
有
Y1HGold[诱饵/AbAi]+靶
SD/-Leu/AbA
有
酵母菌
SD/-Leu
有
Y1HGold[突变/AbAi]+靶
SD/-Leu/AbA
无（或者很小）

B 假阳性
样品
选择培养基
2 mm清晰的克隆
酵母菌
SD/-Leu
有
Y1HGold[诱饵/AbAi]+靶
SD/-Leu/AbA
有
酵母菌
SD/-Leu
有
Y1HGold[突变/AbAi]+靶
SD/-Leu/AbA
有
（5） 阳性克隆的测序分析
一旦相互作用被验证为阳性，就可以测序鉴定捕获载体的插入cDNA片段，验证与GAL4 AD序列融合的开放阅读框（ORF）序列，并与GenBank、EMBL或其他数据库中的序列进行比较。