微生物限度检查标准程序.doc

微生物限度检查标准程序
微生物限度检查标准程序

1. 目的：建立个微生物限度检查标准程序。
2. 范围：适用于各种原辅料、部分成品及验证的微生物限度检查的操作。
3. 职责：检验人员对本规程的实施负责。
4. 程序：
4．1 总则：
4．1．1 本法是指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。
4．1．2 供试品应随机抽样。一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。
4．1．3检查全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。
4．1．4除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30~35℃，霉菌培养温度为25~28℃，控制菌培养温度为36±1℃。
4．1．5检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。
4．2供试品的检验量 每批供试品检验量一般为10g或10ml。供试品须取自2个以上的包装单位。
4．3供试液的制备 按供试品的理化特性及生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。
4．3．1 液体供试品 取供试品10ml，加入稀释剂90ml中，混匀，作为供试液。
4．3．2 固体供试品
称取供试品10g，置0.9%无菌氯化钠100ml中，用匀浆仪或其它适宜办法，混匀后，作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量聚山梨酯80，并适当加温，但不应超过45℃。
4．3．3 含抑菌成份供试品
供试品如干扰控制菌检验，可用下列方法处理后，依法检查。
4．3．3．1 稀释法
将供试液种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。
4．3．3．2 离心沉淀集菌法
取规定量的供试液，离心（每分钟3000转）30min，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，再稀释成原规定量的供试液。如有不溶性药渣，可将离心（每分钟500转）5min，取全部上层液，再行集菌处理。
4．3．3．3 薄膜过滤法
取规定量的供试液，置稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm，孔径不大于0.45um±0.2um微孔滤膜的薄膜过滤器内，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜3次，每次50~100ml，取出滤膜备检。
4．3．3．4 中和法
凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。
4．4 对照用菌液 控制菌检查均应做相应已知菌的对照试验。对照菌株为
大肠杆菌[CMCC（B）44 102]。取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养
物1白金耳，接种置营养肉汤培养基内，培养18~20小时，稀释至1:106。对照菌的加入量为50~100个。
4．5 检查法
4．5．1 细菌、霉菌计数
4．5．1．1 平皿菌落计数法
4．5．1．1．1 取均匀供试液，进一步稀释成1:102、1:103等适宜的稀释级。
分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml，置直径约90mm的平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释级应作2~3个平皿。
营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。在特殊情况下，前者同时点计霉菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数。
4．5．1．1．2菌数测定阴性对照试验 取供试验用的稀释剂各1ml置于4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。
细菌培养时间为48h，分别在24h及48h点计菌落数，一般以48h菌落数为准。霉菌培养时间为72h，分别在48h及72h点计菌落数，一般以72h菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。
点计后，计算各稀释级平均菌落数，按菌落报告规则报告菌数。
4．5．1．1．3 菌数报告规则 细菌宜选取平均菌落数在30~300之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数在30~100之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。如有1个稀释级在30~300（30~100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有2个稀释级在30~300（30~100）之间时，按下式计算两级比值：

高稀释级的平均菌落数×稀释倍数
比值=
低稀释级的平均菌落×稀释倍数

当比值≤2时，以两稀释级的均值报告，当比值>2时，以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30~300之间时，以后2个稀释级计算级间比值报告；如各稀释级的平均菌落数均不在30~300之间，以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。如当1:10（或1:100）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1:10）稀释级时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。
4．5．1．2 培养基稀释法 取供试液（原液或1:10、1:100供试液）3份，每份各1ml，分别注入5个平皿内（每皿各0.2ml）。每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。每1ml注入的5个平板的菌落数之和，即为每1ml的菌落数，共得3组数据。以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。
如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，则报告菌落数为小于10个。
4．5．2 控制菌（大肠杆菌）检查
4．5．2．1 取胆盐乳糖培养基3份，每份各100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50~100个作阳性对照，第3份加入及供试液等量的稀释液作阴性对照。培养18~24h（必要时可延至48h）。阴性对照应无菌生长。
4．5．2．2 取上述3份的培养物各0.2ml，分别接种至5mlMUG培养基管内培养，分别于5h、24h时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外光下观察。阳性对照管呈现荧光，MUG阳性。供试液的MUG管呈现荧光，MUG阳性；无荧光，MUG阴性。然后加数滴靛基质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。
4．5．2．3当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明，并证明无菌生长，判未检出大肠杆菌。供试液MUG阳性，靛基质阳性，判检出大肠杆菌；MUG阴性，靛基质阴性，判未检出大肠杆菌。
4．5．2．4如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，均应取供试液胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养18~24h，如上述供试液培养物的分离平板无菌落生长，判未检出大肠杆菌。或有菌落生长，应挑选2~3可疑菌落作靛基质试验（I）、甲基红试验（M）、乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）、枸橼酸盐利用试验（C）及革兰染色、镜检，按表1规定判定结果。
4．5．2．5靛基质试验（I） 取可疑菌落或斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，培养24h，沿管壁加入靛基质试液数滴，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。
甲基红试验（M） 取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于管内加入甲基红指示液数滴，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。
乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于每2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%KOH溶液0.4ml，充分振摇，在4h内出现红色为阳性，无红色反应为阴性。
枸橼酸盐利用试验（C） 取可疑菌落或斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基的斜面上，一般培养48~72h，培养基斜面有菌落生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变为阴性。
结果判断见表1。对及MUG-I反应不符的可疑菌株（见注①、②），应重新分离培养，再作生化试验证实。
表1 MUG的结果判断
MUG-I
曙红亚甲蓝琼脂
IMVic
结 果
+ +

检出大肠杆菌
- -

未检出大肠杆菌
+ -
无菌生长

未检出大肠杆菌
+ -
有菌生长
-+--①
检出大肠杆菌③
- +
有菌生长
++--②
检出大肠杆菌③
注：①、②如①出现++--或②出现-+--，均应重新分离菌株，再作MUG-I和IMVic试验。
③革兰阴性杆菌。
5．仪器和用具
5．1 操作台：检验操作在超净工作台内进行。工作台设在半无菌操作室内，室内设有紫外线灯使室内灭菌，室内装有空调设备，控制室温在20~25℃。
5．2 恒温培养箱：两台，各设定在35~37℃及24~26℃，分别作细菌和霉菌培养用。
5．3 高压蒸汽灭菌锅
5．4 电热干燥箱：50~300℃。
5．5 扭力天平
5．6 酒精灯
5．7 玻璃器皿：培养皿、刻度吸管、三角烧瓶、毛细滴管、刻度离心管、试管等。
6．试液（试剂）
6．10.9% 无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，121℃灭
菌20分钟。
6．2 95%乙醇。
6．3 靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边滴边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深；或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。
6．4 a-萘酚乙醇试液 取a-萘酚6.0g，加无水乙醇使溶解成100ml。
6．5 甲基红试液 取甲基红0.1g，加入95%乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml，即得。
6．6 40%氢氧化钾试液 取氢氧化钾40.0g，加水使溶解成100ml。
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