蛋白质分离纯化技术.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章蛋白质的分离与纯化,1,第二章 蛋白质的分离与纯化,一、蛋白质的测定技术,紫外分光光度法,比色法,二、蛋白质的分离提取,蛋白质材料的处理,蛋白质的粗分离,蛋白质的纯化,三、蛋白质的结构解析,2,一、蛋白质的测定技术,3,定义：蛋白质浓度或含量的测定,方法：,凯氏定氮法,紫外分光光度法,比色法,双缩尿法（,Biuret,法）,Folin,酚试剂法（,Lowry,法）,考马斯亮蓝法（,Bradford,法）,BCA,法,4,测定蛋白质含量的是我们研究蛋白质功能等方面的基础，这种技术也广泛应用于食品质量检测方面等。,在选择方法时应考虑：,实验对测定所要求的灵敏度和精确度；,蛋白质的性质；,溶液中存在的干扰物质；,测定所要花费的时间。,5,一、凯氏定氮法（,Kieldahl Method,）,测定蛋白质含量的经典方法。,目前测定蛋白质含量的标准方法。,测定试样中,总有机氮,最准确和重现性最好的方法之一。,原理：,蛋白质的含氮量约,16%,，含氮量因构成蛋白质的氨基酸残基的不同有所差别，在,14-19%,之间。,测定蛋白质样品的含氮量，乘以,6.25,即为蛋白质的含量（以蛋白质平均含氮量,16%,计算）。,6,测定分,两步,：,用沸浓硫酸消化，并以硫酸铜为催化剂，使碳、氢分别以二氧化碳及水蒸汽形态逸去，而氮转为铵盐。此过程需时较长，可达数小时。,加碱，并将氨自碱液中蒸至标准酸液中，测定中和氨所消耗的酸量，计算出样品中含氮量，再乘以,6,25,（经验平均值），则得蛋白质含量。,7,反应：以甘氨酸为例,CH,2,COOH|+3H,2,SO,4,2CO,2,+3SO,2,+4H,2,O+NH,3,(1)NH,2,2NH,3,+H,2,SO,4,(NH4),2,SO,4,(2),(NH,4,),2,SO,4,+2NaOH,2H,2,O+Na,2,SO,4,+2NH,3,(3),硫酸铜为催化剂（促进有机含氮化合物分解完全），,K,2,SO,4,以提高溶液的沸点（,290,o,C,提高到,400,o,C,）。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。,8,特点：,时间较长；,蛋白质中含氮量通常并不确定，因为不同蛋白质含 氮量不相同，使得计算所得蛋白质量只是具有相当误差的近似值；,若欲得精确值，需预先将蛋白质分离，可以以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。,当有其他含氮化合物时有干扰。,凯氏法有常量法、半微量法及微量法（可测样品含氮量为,0.10 mg,以下）。,9,二、紫外分光光度法,紫外（或可见）分光光度法：以溶液中物质的分子或离子对紫外（或可见）光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。,朗伯,-,比耳定律：,A=lg(1/T)=Kbc A,为吸光度,T,为透射比,是透过光强度比上入射光强度。,c,为吸光物质的浓度，,b,为吸收层厚度。,物理意义：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度,A,与吸光物质的浓度,c,及吸收层厚度,b,成正比。,10,紫外分光光度法测定蛋白质含量的,实验原理,1.,蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基含有,共轭双键,，使蛋白质具有吸收近紫外光的性质。吸收高峰在,280,nm,处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。,2.,蛋白质溶液在,238,nm,的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。,11,紫外分光光度法,标准曲线：以标准蛋白的吸光度,A,为纵坐标，其浓度,c,为横坐标的标准曲线。,测出被试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。,分光光度法测量图,12,常用的方法（四种）,A,280,法,因蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸在,280nm,处具有最大吸收，且各种蛋白质的这两种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在,280nm,处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取,280nm,的吸光度值,A280,。蛋白质浓度可控制在,0.1,1.0mg/ml,左右。通常用,1cm,光径的标准石英比色皿，盛有浓度为,1mg/ml,的蛋白质溶液时，,A280,约为,1.0,左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。,许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值有文献数据可查。,A238,法,(,肽键测定法,),蛋白质溶液在,238nm,处的光吸收的强弱,与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列,50,500mg/ml,已知浓度的,5.0ml,蛋白质溶液，测定,238nm,的光吸收值,A238,以,A238,为纵座标,蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。,13,A,280,与,A,260,吸收差法,核酸对紫外光有很强的吸收，在,280nm,和,260nm,处都有吸收，其吸收高峰在,260nm,附近。,含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其,A280,和,A260,，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。,蛋白质浓度,=1.45,A280,0.74,A260,(mg/ml),A,215,与,A,235,吸收差法,215nm,和,235nm,光吸收差值在一定范围与蛋白质浓度成正比。,用,215nm,和,235nm,光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的误差。,对稀溶液中蛋白质浓度测定，可选用,215nm,和,235nm,光吸收差法。,干扰物质的影响较多。,14,优点：,紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。,缺点：,1.,测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。,2.,若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。,3.,蛋白质的最大吸收波长因,pH,的,改变而有变化。,15,三、比色法（,colorimetry,）,定义：,以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。,比色分析对显色反应的基本要求：,1.,反应应具有较高灵敏度和选择性；,2.,反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定；,3.,反应生成的有色化合物和显色剂的颜色差别较大等。,理论基础：,朗伯,-,比尔定律,(A,Kbc),16,（一）双缩脲法（,Biuret,法）,原理：双缩脲（,NH,2,CONHCONH,2,）是两个分子脲经,180,左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与,CuSO,4,形成紫色络合物（,540nm,），称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能通过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。,17,紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。,测定范围为,1,10mg/mL,蛋白质。,干扰物质：硫酸铵、,Tris,缓冲液和某些氨基酸等。,18,双缩脲法（,Biuret,法）过程,标准曲线的测定：取,12,支试管分两组，分别加入,0,，,0.2,，,0.4,，,0.6,，,0.8,，,1.0,毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到,1,毫升，然后加入,4,毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（,20-25,）下放置,30,分钟，于,540nm,处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。,样品的测定：取,2-3,个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过,10mg/ml,。,19,双缩脲法（,Biuret,法）,特点：,较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。,主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。,20,（二）,Folin,酚试剂法（,Lowry,法）,实验原理,:,蛋白质中的肽键在碱性条件下与,Cu,2+,反应，生产紫红色蛋白质,-Cu,2+,复合物，这一复合物中的氨基酸残基（主要是酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸）还原,Folin,酚试剂中的磷钼酸盐,-,磷钨酸盐，产生钼兰和钨兰复合物的深兰色（,745-750nm,），颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。,此法中由于加入,Folin,酚试剂强化了双缩脲反应，增加显色量，灵敏度为双缩脲法的,100,倍。,Folin,酚试剂法最早由,Lowry,确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。,21,Folin,酚试剂法（,Lowry,法）,优点：灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。,缺点：,1.,费时间较长，要精确控制操作时间（,显色随时间不断加深）；,2.,标准曲线也不是严格的直线形式，干扰物质较多。,由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。,此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达,5,g,。通常测定范围是,20,250,g,。,22,Folin,酚试剂法（,Lowry,法）,注意：,对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰,Lowry,反应。而且对后者的影响还要大得多。如酚类、柠檬酸、硫酸铵、,Tris,缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素、硫酸纳、硝酸纳、三氯乙酸、乙醇、乙醚、丙酮等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。,测定时，加,Folin-,酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性条件下稳定，上述还原反应只在,pH=10,的情况下发生，故当,Folin-,酚试剂加到碱性的铜,-,蛋白质溶液中时，须立即混匀，以便在磷钼酸,-,磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。,23,（三）考马斯亮蓝法（,Bradford,法）,1976,年由,Bradford,建立的考马斯亮兰法（,Bradford,法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。,24,实验原理：考马斯亮兰,G-250,染料,，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置,(,max),由,465nm,变为,595nm,，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸和赖氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。,在,595nm,下测定的吸光度值,A,595,，与蛋白质浓度成正比。,25,考马斯亮兰,G-250,考马斯亮蓝法（,Bradford,法）,优点：,1.,灵敏度高，比,Lowry,法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达,1,g,。这是因为蛋白质与染料结合后产生,的颜色变化很大，光吸收值随蛋白质浓度的变化比,Lowry,法要大的多。,2.,测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要,5,分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约,2,分钟即可完成，其颜色可以在,1,小时内保持稳定。,3.,干扰物质少。如干扰,Lowry,法的,K,、,Na,、,Mg2+,离子、,Tris,缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇等均不干扰此测定法。,26,考马斯亮蓝法（,Bradford,法）,缺点：,1.,由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。,2.,仍有一些物质干扰此法的测定，如：去污剂、,Triton X-100,、十二烷基硫酸钠（,SDS,）等。,注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）。校正：,0.05mg/ml BSA,溶液的,A,595,约为,0.29,。,27,（四）二奎琳甲酸法,BCA(,bicinchoninic,acid,)法,原理：,Bicinchoninic acid(BCA),法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与,Lowery,法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与,Cu,2+,络合并将,Cu,2+,还原成,Cu,1+,。,BCA,与,Cu,1+,结合形成稳定的紫蓝色复合物，,在,562nm,处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。,28,BCA,与,Lowery,法相比，,BCA,蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳,并且受干扰物质影响小。,与,Bradford,法相比，,BCA,法的显著优点是不受去垢剂的影响。,29,BCA(,bicinchoninic,acid,)法,特点,1.,操作简单，快速，,45,分钟内完成测定，比经典的,Lowery,法快,4,倍且更加方便,.,2.,准确灵敏，试剂稳定性好，,BCA,试剂的蛋白质测定范围是,20-200g/ml,，微量,BCA,测定范围在,0.5-10g/ml,。,3.,经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；,4.,抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响；,30,方法,灵敏度,时间,原理,干扰物质,说明,凯氏定氮法（,Kjedahl,法）,灵敏度低，适用于,0.2 1.0mg,氮，误差为,2,费时,8,10,小时,将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定,非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）,用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长,紫外吸收法,较为灵敏,50,100,m,g,，比色杯的最小测量体积为,0.1ml,快速,5,10,分钟,蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在,280nm,处的光吸收,各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸,用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正；不消耗样品，测定后样品仍能回收利用,双缩脲法（,Biuret,法）,灵敏度低,1,20mg,中速,2030,分钟,多肽键碱性,Cu,2,生成紫色络合物,硫酸铵；,Tris,缓冲液；,某些氨基酸,用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似,Folin,酚试剂法（,Lowry,法）,灵敏度高,1,5,m,g,慢速,40,60,分钟,双缩脲反应；磷钼酸磷钨酸试剂被,Tyr,和,Phe,还原,硫酸铵；,Tris,缓冲液；甘氨酸；各种硫醇,耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化,;,标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差,考马斯亮蓝法,(Bradford,法,),灵敏度更高,1,5,m,g,最小测量体积,0.1ml,快速,5,15,分钟,考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其,l,max,由,465nm,变为,595nm,强碱性缓冲液；,TritonX-100;,SDS,较好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化,;,标准曲线有轻微的非线性,BCA,法,灵敏度非常高,20,200,m,g,微量,BCA,为,0.5,10,m,g,较快速,40,分钟内,在碱性环境下蛋白质与,Cu,2+,络合并将,Cu,2+,还原成,Cu,1+,，与,BCA,形成深紫红色复合物,螯合剂；略高浓度的还原剂,抗干扰能力强，,蛋白不可逆的变性,31,