环境化学物的特殊毒性及其评价遗传毒性.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第六章 环境污染物的特殊毒性及其评价,主讲教师：刘 薇,大连理工大学 环境学院,生态毒理学,(Ecotoxicology),一般毒性和特殊毒性,急性毒性,亚慢性毒性,慢性毒性,蓄积毒性,局部毒性,致突变作用,致癌作用,生殖和发育毒性,一般毒性,特殊毒性,安全性评价,3.,污染物致突变作用机理,4.,污染物致突变的不良后果,5.,污染物致突变作用的评价,2.,遗传损伤的类型,第一节 环境化学物的致突变性及其评价,小鼠骨髓细胞微核实验,环境毒理学,实验,1.,引言,突变,(,mutation,),是一种遗传状态、可以通过复制而遗传的,DNA,结构的任何永久性改变。,遗传,变异,1.,父、母,DNA,重组,2.,基因突变,3.,染色体组成或细胞质变化,突变,自发突变,诱发突变,1.,引言,1.1,环境致突变作用,(,environmental mutagenesis,),化学物质及其他环境因素导致生物体遗传机构的改变，,可以导致人类的某些遗传性疾病且与癌症的发生有关,1.,引言,自发突变,(,spontaneous mutation,),：,自然条件下发生，概率极低，生物进化的基础,诱发突变,(,induced mutation,),：,人为地或由各种因素诱发产生,化学因素,环境致突变作用,物理因素,生物因素,1.,引言,时间,事件,作者,19,04,发现,X,射线可以改变生殖细胞的遗传物质,de Vries,一些氧化剂对细菌和真菌诱变作用的研究,Franz&Elizabeth,1927,用,X,射线照射发现可以引起果蝇基因突变,Mller,194,2,发现芥子气可诱发果蝇基因和染色体畸变,Charlotte&Robson,1943,发现氨基甲酸乙酯有诱变性,Franzoechlkers,1946-48,发现环氧乙烷、乙烯亚胺、重氮甲烷、缩水甘油等具有诱变性,Rapoport,1969,成立国际环境诱变剂学会,1.2,环境致突变作用研究简史,遗传毒理学,(Genetic Toxicology),化学性和放射性因素的致突变作用和机理、对人类接触致突变物引起的健康效应和预防措施的科学。,研究内容,潜在的致突变作用,致突变作用机制,建立新的检测方法,评价致突变物对人类健康的威胁,1.,引言,1.3,环境致突变剂,(Environmental Mutagen,）,分组,特点,类别,第一组,人工合成，仅,在一定条件下应,用的诱变剂,1.,药品：抗癌药、抗菌素、麻醉剂和避孕药等,2.,农药：杀虫剂、灭鼠剂、除锈剂、除霉剂及其残留物,3.,食品添加剂,4.,化妆品,5.,生物污染,第二组,工业生产中应,用或生产的环境,诱变剂,1.,工业烷化剂,2.,有机溶剂及有机金属化合物,3.,水体污染物,4.,空气污染物,5.,重金属及其化合物,第三组,自然诱变剂与,食品加工过程中,产生的诱变剂,1.,生物碱,2.,微生物代谢产物,3.,食品加工中产生的诱变剂,-,9,-,2.,遗传损伤的类型,机制,以,DNA,为靶,不以,DNA,为靶,基因突变,染色体结构畸变,染色体数目畸变,细胞水平,分子水平,损伤牵涉范围,显微镜,可见度,基因突变,染色体突变,基因组突变,碱基置换,移码突变,大段损伤,染色体数目畸变,染色体结构畸变,DNA,链中正常的碱基配对,A:,腺嘌呤,T:,胸腺嘧啶,C:,胞嘧啶,G:,鸟嘌呤,A:,腺嘌呤,T:,胸腺嘧啶,G:,鸟嘌呤,C:,胞嘧啶,2.,遗传损伤的类型,2.1,基因突变,基因突变,(,gene mutation,),：,基因中,DNA,序列的改变，又称为点突变。,碱基置换,转换,A G T C,颠换,A or G C or T,同义突变,：未改变基因产物氨基酸序列,错义突变,：引起产物氨基酸序列改变,无义突变,：使蛋白质合成中止,2.1,基因突变,移码突变,：从,mRNA,到蛋白质翻译过程中遗传密码子读码顺序的突变。,使基因产物发生大的改变，引起明显的表型效应，常导致致死性突变,大段损伤,：,DNA,序列上有较长的一段序列的重排分布，也叫,DNA,重排。,2.1,基因突变,2.2,染色体突变,染色体突变,(,chromosomal mutation,),：染色体结构的改变，又称为染色体畸变。,断裂剂,(,clastogen,),：能引起染色体畸变的外源化学物。,染色单体型畸变,染色体型畸变,a,染色单体断裂,b,三辐射体,c.,染色体断片,d.,双着丝点染色体,e.,环状染色体,f-g.,无着丝点断片,2.2,染色体突变,2.3,基因组突变,基因组突变,(,genomic mutation,),：基因组中染色体数目的改变，又称为染色体数目畸变。,类型,公式,染色体组,整倍体,单倍体,二倍体,三倍体,四倍体,非整倍体,单体,三体,四体,双三体,缺体,n,2n,3n,4n,2n-1,2n+1,2n+2,2n+1+1,2n-2,(ABCD),(ABCD)(ABCD),(ABCD)(ABCD)(ABCD),(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD),(ABCD),(ABC),(ABCD)(ABCD),(A),(ABCD)(ABCD),(AA),(ABCD)(ABCD),(AB),(ABC)(ABC),(1),大加合物,代表物：多环芳烃、生物毒素、黄曲霉毒素,B,和芳香胺类,后 果：,DNA,的立体构象发生明显变化，阻断受损部位,DNA,的半保留复制和转录。,2.,化合物的致突变机理,2.1,DNA,加合物和交联分子的形成,苯并,(a),芘,芳香胺,黄曲霉毒素,B,(2),小加合物,代表物：烷化剂、亚硝基化合物,后 果：对,DNA,的构象影响较小，易导致碱基错误配对。,DNA,甲基化、乙基化,2.1,DNA,加合物和交联分子的形成,(3),DNA-DNA,交联,：,DNA,分子上一条链的碱基与互补链上的相应碱基形成共价连接.,代表物：如亚硝酸、丝裂霉素,C、,氮和硫的芥子气、各种铂的衍生物,后 果：,DNA,在复制中不能解链，螺旋局部形成，,DNA,复制和转录完全停止，细胞死亡,丝裂霉素,C,碱基类似物,：与天然碱基的结构非常相似的外源化合物,后 果：引发碱基替代突变,2.2,碱基类似物在,DNA,复制时的掺入,亚硝基引起的氧化脱氨反应,NH,2,OH,的致突变作用,作用机制复杂，不同,PH,、,NH,2,OH,浓度，产物不同,烷化剂的致突变作用,硫酸二甲酯、甲基磺酸乙酯、乙基磺酸乙酯、,MNNG,2.3 DNA,分子上碱基的化学修饰,2.4,嵌合剂的致突变作用,原黄素,丫啶橙,代表物,：丫啶橙、原黄素等丫啶类染料分子,方 式,：以静电吸附形式嵌入,DNA,单链的碱基之间或,DNA,双螺旋结构的相邻核苷酸之间,后 果,：移码突变,化合物的致突变机理,1.,碱基损伤,致突变物改变或破坏碱基的正常结构。,(1),碱基错配,(2),平面大分子嵌入,DNA,链,(3),碱基类似物取代,(4),碱基化学结构改变或破坏,2.DNA,链结构损伤,(1),形成嘧啶二聚体,(2),形成,DNA,加合物和,DNA,蛋白质交联物,3.,影响细胞分裂过程,4.,对修复酶的影响,激活原癌基因或灭活抑癌基因,化学、物理、生物因素,原癌基因点突变,原癌基因扩增,染色体易位与基因重排,原癌基因抑制解除,抑癌基因缺失,原癌基因,抑癌基因,癌基因,致突变因素,机体对突变的修复,DNA,修复,直接修复,切除修复,O,6,甲基鸟嘌呤甲基转移酶,二聚体光解酶,错配碱基修复,碱基切除修复,核苷酸切除修复,复制后修复,呼救性修复,嘌呤插入酶,DNA,连接酶,遗传毒性的后果及其形成机制,致突变作用,体细胞突变,生殖细胞突变,良性,肿瘤,恶性,转化,细胞,衰老,分化的胚胎细胞受损,未分化的胚胎细胞,显性,致死,隐性,致死,存活,突变,动脉硬化,未知疾病,癌变,老化,出生缺陷(流产/死胎)癌变,出生缺陷(功能或结构畸形),流产,死产,出生缺陷基因负荷,先天性疾病,3.,遗传毒性检测实验,2,染色体畸变试验,哺乳动物细胞染色体畸变试验 微核试验,显性致死试验 小鼠遗传易位试验,3 DNA,损伤与重组试验,细菌,DNA,修复试验 程序外,DNA,合成试验,姊妹染色单体交换,(SCE),试验,SOS,显色试验,(SOS chromotest),1,基因突变试验,原核细胞微生物试验 真核微生物试验,昆虫试验 哺乳动物体细胞体外试验,小鼠基因突变试验,3.1,原核细胞微生物试验,(,Ames,试验,),利用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变株，根据受试物是否诱发沙门氏菌突变型,(his,),回复为野生型,(his,),的形成菌落的能力，测定受试物。,正向突变,回复突变,野生型,his,+,突变型,his,代谢活化系统,(S-9mix),受试物,Ames,试验方法,沙门氏菌突变型,(his,),受试物,大鼠肝微粒体酶,(,S-9),顶层琼脂培养基,混匀,37,48h,低剂量,中剂量,高剂量,对照组,Ames,试验标准菌株和敏感性,标准菌株,TA,97,移码突变,TA,98,移码突变,TA,100,碱基置换突变,TA,102,碱基置换突变、对醛类、过氧化物及,DNA,交链剂比较敏感,脂多糖突变,(rfa),增加细胞壁的通透性,uvrB,缺失,DNA,损伤后修复力降低,R,因子,增高诱变率,哺乳动物细胞（正向）突变试验,细胞株：,小鼠淋巴瘤细胞,(L5178Y),中国仓鼠肺细胞,(V79),中国仓鼠卵巢,(CHO),人成纤维细胞或淋巴细胞,哺乳动物细胞野生型,BrDU,死亡,哺乳动物细胞野生型,BrDU,正向突变,受试物,生长,（抗药性）,3.2,哺乳动物体细胞致突变体外试验,3.3,染色体畸变试验,细胞受到诱变剂的作用后，,染色体数目和较大范围的结构改变,。在细胞分裂中期，利用光学显微镜下直接观察到这些变化。,体外实验,中国仓鼠卵巢细胞,中国仓鼠肺细胞,外周血淋巴细胞,体内实验,小鼠骨髓细胞染色体畸变试验,小鼠睾丸细胞,*,细胞分裂周期,原理,染色体畸变试验方法,急性试验 染毒一次,亚急性试验 连续染毒,5,天,慢性实验 连续染毒,3,个月,淋巴细胞,培养细胞,中期相细胞,受试物,培养基,染色体数目 结构,秋水仙素,阻止纺垂丝形成,处死前,2-4h,腹腔注射,体外实验,哺乳动物,经口或腹腔注射,骨髓，睾丸细胞,体内实验,染色体畸变,染色体结构异常,裂隙、断裂、缺失、微小体、着丝点环、无着丝点环等,数目异常,多倍体或非整倍体,3.4,微核试验,在致突变剂作用下，染色体损伤产生的无着丝点染色体断片和环，在细胞分列时不能定向移动进入细胞核，残留在细胞质中。微核的着色和细胞核相同，比正常细胞核小。,本试验可以检测受试物的染色体断裂作用和非整倍体诱变作用。,微核试验方法,腹腔注射受试物,骨髓,嗜多染,RBC,微核出现率,(1/1000),小鼠,24h,外周血淋巴细胞,微核试验,细胞培养微核试验,植物细胞,非哺乳类动物细胞,3,.5,显性致死试验,雄鼠,连续染毒,5,天,从染毒第一天起经过一个精子发育周期,（大鼠,60,天，小鼠,35,天）,未交配过的雌鼠同笼,5,天,妊娠,1214,天 剖腹,检查活胎数、早死胎数、晚死胎数,染毒后交配时期,1w,输精管和附睾中的精子,2w,精子后期,3w,精子前期,4w,精母细胞后期,5w,精母细胞前期,6w,精原细胞,以小鼠为例,3.6,姊妹染色单体交换试验（,SCE),SCE,是指一个同源染色体内，两个染色单体之间,DNA,复制产物发生互相交换，可能与染色体断裂和重接有关,。,判断受试物是否具有,DNA,损伤作用。,SCE,试验原理示意图,第一次,细胞分裂,BrDU,BrDU,掺入到新合成的,DNA,链,第二次,细胞分裂,BrDU,掺入到新合成的,DNA,链,SCE,交换,BrDU,遗传毒理学试验可信性评价,实验方法 灵敏性,(%),特异性,(%),准确性,(,),Ames,试验,17/19(89%)3/10(30%)20/29(69%),骨髓细胞染色体畸,18/18(100%)2/10(20%)20/28(71%),变试验或微核试验,显性致死试验,18/18(100%)8/10(80%)26/28(93%),遗传毒性检测实验组合原则,1.,应包括每一类型的遗传终点。,应能检出基因突变、染色体断裂、重组作用、非整倍体或多倍体改变。,Ames,试验，微核试验，细菌,DNA,修复试验，,SCE,。,2.,应包括进化程度不同的物种,。,3.,体内外实验配合。,体外试验应有体外活化系统。,4.,应包括生殖细胞和体细胞。,USEPA,遗传毒性评价试验程序,特异座位试验,形态学改变,生物化学改变,体内骨髓细胞遗传学试验,染色体畸变试验,微核试验,Ames,试验,体外哺乳动物细胞基因突变试验,与性腺,DNA,相互作用的试验,显性致死试验,可遗传易位试验,第三阶段,第二阶段,第一阶段,思考题,1.,毒物代谢动力学常用主要指标及其毒理学意义。,2.,毒物代谢的一级速率过程和零级速率过程的特点。,3.,研究污染物,生物转化的意义和由微粒体混合功能氧化酶催化的氧化反应类型。,4.,简述影响生物转化的因素。,5.,环境污染物的毒性效应和毒性反应。,6.,剂量,-,效应关系和剂量,-,反应关系及其毒理学意义。,