多聚酶链式反应扩增DNA片段-.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验四 PCR基因扩增,1,实验目的,通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。,2,实验原理,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或,DNA,序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。,在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2,n,倍。,3,PCR技术的原理,1.变性,：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。,2.退火,：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。,3.延伸,：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按53的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。,4,(c),(b),引物2,5,3,3,3,5,5,(d),新引物,5,3,靶DNA的扩增,(a),5,3,引物1,3,5,3,5,引物2互补链,引物1互补链,单位长度的链,不同长度的链,5,3,3,5,引物1互补链,引物2互补链,目的片段（不同长度的链未示出）,聚合酶链式反应示意图,(e),(f),(g),5,6,7,8,9,10,温度（,）,时间（min）,94,72,60,94,变性（1min）,60,退火（1min）,72,延伸,（1.5min）,循环1 循环2 循环3,PCR反应的温度循环周期,PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94变性1min，60 退火1min，72 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。,11,一般PCR反应条件,12,实验仪器,电泳仪,13,琼脂糖凝胶电泳槽,14,PCR仪,15,凝胶成像系统,16,移液器,17,实验材料,1、DNA模板,2、4种dNTP,3、引物1、引物2,4、Taq酶,5、琼脂糖,6、DNA相对分子质量标准物,7、吸头、50ul PCR管,18,试剂,10PCR缓冲液(含Mg,2,),4dNTP(每种1mmol),Tag酶 1U/ul,DNA模板,引物1:,5-,GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3,引物2:5-GAC,CTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3,引物溶液浓度 10pmol/ul,19,实验步骤,1在0.5ml RCR管内配置20ul反应体系：,CK(ul),1#(ul),模板,0,1,引物,1,0.4,0.4,引物,2,0.4,0.4,10 PCR Buffer,2,2,Taq,酶,0.5,0.5,dNTPs,0.4,0.4,ddH,2,O,14.3,15.3,Total,20,20,20,PCR反应程序,(1)94变性5min，,(2)94变性1min，,(3)52 退火1min，,(4)72 延伸1min。,(5)重复(2)-(4)30次,（6）72 延伸1min。,21,实验,报告,要求：,1、写出本实验目的、原理；,2、实验器材及实验步骤；,3、列出实验结果示意图并分析原因。,22,实验结果,PCR结果。1、对照(无模板)；26、PCR产物（5ul样品）,23,