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生物安全手册
目录
目录 1
第一部分 基本规范 2
进入规定 2
人员防护 3
实验室工作区 3
生物安全管理 4
第二部分 实验室技术 4
移液管和移液辅助器的使用 5
生物安全柜的使用 5
血清的分离 6
离心机的使用 6
冰箱与冰柜的维护和使用 7
装有冻干物质安瓿的开启 8
第三部分 消毒和灭菌 8
一、定义 8
二、化学杀菌剂 9
氯（次氯酸钠） 10
乙醇 10
碘和碘伏 11
三、清除局部环境的污染 12
四、洗手／清除手部污染 12
五、高压灭菌 12
高压灭菌参数 12
高压灭菌器的装载 13
高压灭菌器使用注意事项 13
附录1 14
设备的安全性 14
表A1-1 可能产生危害的仪器设备及其操作 14
表A1-2 仪器设备相关事故的原因 8
表A1-3 生物安全设备 9
表A1-4 个体防护装备 10

第一部分 基本规范
根据感染性微生物的相对危害程度（危险度2级，病原体能够对人致病，但对实验室工作人员或环境不易导致严重危害），本实验室为基础实验室，属于二级生物安全水平。
进入规定
1、在实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志（图1）。

2、只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。
3、实验室的门应保持关闭。
4、儿童不应被批准或允许进入实验室工作区域。
5、与实验室工作无关的动物不得带入实验室。
人员防护
1、在HIV实验室工作时，任何时候都必须穿着工作服。
2、在进行可能直接或意外接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性的材料的操作时，应戴上合适的手套。手套用完后，应先消毒再摘除，随后必须洗手。
3、在处理完感染性实验材料后，以及在离开实验室工作区域前，都必须洗手。
4、为了防止眼睛或面部受到泼溅物、碰撞物或人工紫外线辐射的伤害，必须戴安全眼镜、面罩（面具）或其他防护设备。
5、严禁穿着实验室工作服离开实验室，（如去餐厅、咖啡厅、办公室、图书馆、员工休息室和卫生间）。
6、不得在实验室内穿露脚趾的鞋子。
7、禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜。
8、禁止在实验室工作区域储存食品和饮料。
9、在实验室内用过的工作服不得和日常服装放在同一柜子内。
实验室工作区
1、实验室应保持清洁整齐，严禁摆放和实验无关的物品。
2、发生具有潜在危害性的材料溢出以及在每天工作结束之后，都必须清除工作台面的污染。
3、所有受到污染的材料、标本和培养物在废弃或清洁再利用之前，必须清除污染。
4、在进行包装和运输时必须遵循国家和∕或国际的相关规定。
5、如果窗户可以打开，则应安装防止节肢动物进入的纱窗。
生物安全管理
1、实验室主任（对实验室直接负责的人员）负责制订和采用生物安全管理计划以及安全或操作手册。
2、实验室主管（向实验室主任汇报）应当保证提供常规的实验室安全培训。
3、要将生物安全实验室的特殊危害告知实验室人员，同时要求他们阅读生物安全或操作手册，并遵循标准的操作和规程。实验室主管应当确保所有实验室人员都了解这些要求。实验室内应备有可供取阅的安全或操作手册。
4、应当制订节肢动物和啮齿动物的控制方案。
5、如有必要，应为所有实验室人员提供适宜的医学评估、监测和治疗，并应妥善保存相应的医学记录。
第二部分 实验室技术
实验室伤害以及与工作有关的感染主要是由于人为失误﹑不良实验技术以及仪器使用不当造成的。本部分概要介绍了避免或尽量减少这类常见问
题的技术和方法。
移液管和移液辅助器的使用
1、应用移液辅助器，严禁用口吸取。
2、所有移液管应带有棉塞以减少移液器具的污染。
3、不能向含有感染性物质的溶液中吹入气体。
4、感染性物质不能使用移液管反复吹吸混合。
5、不能将液体从移液管内用力吹出。
6、污染的移液管应完全浸入适当的消毒液中，并在消毒液中浸泡适当时间后再进行处理。
7、盛放废弃移液管的容器应当放在生物安全柜内。
8、为了避免感染性物质从移液管中滴出而扩散，在工作台面应当放置一块吸有消毒液的纸，使用后将其按感染性废弃物处理。
生物安全柜的使用
1、生物安全柜运行正常时才能使用。
2、生物安全柜在使用中不能打开玻璃观察挡板。
3、安全柜内应尽量少放置器材或标本，不能影响后部压力排风系统的气流循环。
4、所有工作必须在工作台面的中后部进行，并能够通过玻璃观察挡板看到。
5、尽量减少操作者身后的人员活动。
6、操作者不应反复移出和伸进手臂以免干扰气流。
7、不要使实验记录本﹑移液管以及其他物品阻挡空气格栅，因为这将干扰气体流动，引起物品的潜在污染和操作者的暴露。
8、工作完成后以及每天下班前，应使用70%的酒精对生物安全柜的台面进行擦拭，但切忌用酒精擦拭玻璃挡板。
9、在安全柜内的工作开始前和结束后，安全柜的风机应至少运行5min。
10、在生物安全柜内操作时，不能进行文字工作。
血清的分离
1、只有经过严格培训的人员才能进行这项工作。
2、操作时应戴手套以及眼睛和黏膜的保护装置。
3、血液和血清应当小心吸取，而不能倾倒。严禁用口吸液。
4、移液管使用后应完全浸入适当的消毒液中，并在消毒液中浸泡适当的时间，然后再丢弃或灭菌清洗后重复使用。
5、带有血凝块等的废弃标本管，在加盖后应当放在适当的防漏容器内高压灭菌。
离心机的使用
1、应按照操作手册来操作离心机。
2、离心管在使用前应检查是否破损。
3、用于离心的离心管应当始终牢固盖紧。
4、离心桶的装载、平衡、密封和打开必须在生物安全柜内进行。
5、离心桶和十字轴应按重量配对，并在装载离心管后正确平衡。
6、操作指南中应给出液面距离心管管口需要留出的空间大小。
7、空离心桶应当用蒸馏水来平衡。
8、每次使用后，要清除离心桶、转子和离心机腔的污染。
9、使用后应当将离心桶倒置存放使平衡液流干。
10、应当每天检查离心机内转子部位的腔壁是否被污染或弄脏，如污染明显，应重新评估离心操作规范。
冰箱与冰柜的维护和使用
1、冰箱、低温冰箱和干冰柜应当定期除霜和清洁，应清理出所有在储存
过程中破碎的安瓿和试管等物品。清理时应戴厚橡胶手套并进行面部防护，清理后要对内表面进行消毒。
2、储存在冰箱内的所有容器应当清楚地标明内装物品的科学名称、储存日期和储存者的姓名。未标明的或废旧物品应当高压灭菌并丢弃。
3、应当保存一份冻存物品的清单。
4、除非有防爆措施，否则冰箱内不能放置易燃溶液。冰箱门上应注明这一点。
装有冻干物质安瓿的开启
1、首先清除安瓿外表面的污染。
2、如果管内有棉花或纤维塞，可以在管上靠近棉花或纤维塞的中部锉一痕迹。
3、用一团酒精浸泡的棉花将安瓿包起来以保护双手，然后手持安瓿从标记的锉痕处打开。
4、将顶部小心移去并按污染材料处理。
5、如果塞子仍然在安瓿上，用消毒镊子除去。
6、缓慢向安瓿中加入液体来重悬冻干物，避免出现泡沫。
第三部分 消毒和灭菌
一、定义
关于消毒和灭菌有许多不同的术语，下面是生物安全中较常用的：
抗菌剂（antimicrobial） 能够杀死微生物或抑制它们生长和繁殖的制剂。
防腐剂（antiseptic） 能够抑制微生物生长和繁殖但不足将其杀灭的物质。防腐剂经常应用于体表。
生物杀灭剂（biocide） 所有能够杀死生物体的制剂的统称。
化学杀菌剂（chemicalgermcide）用于杀死微生物的化学品或化学混合物。
清除污染（decontamination）去除和／或杀死微生物的任何过程。该词也用于去除或中和有危害的化学品和放射性物质。
消毒剂（disinfectant） 用于杀死微生物的化学品或化学混合物，但不一定杀死其孢子。消毒剂常用于非生命物体或其表面。

消毒（disinfection） 杀死微生物的物理或化学手段，但不一定杀死其孢子。
灭菌剂（microbicide） 能够杀死微生物的化学品或化学混合物。该词常常可以代替“生物杀灭剂”、“化学杀菌剂”或“抗菌剂”。
杀孢子剂（sporocide） 用于杀死微生物和孢子的化学品或化学混合物。
灭菌 （sterilization） 杀死和／或去除所有微生物及其孢子的过程。
二、化学杀菌剂
许多杀菌剂对人或环境有害，应当按生产商的说明小心地进行选择、贮存、操作、使用和废弃。为了个人的安全，建议在稀释化学杀菌剂时应戴手套、围裙和保护眼睛的器具。
下面介绍一些常规使用的化学杀菌剂，并列出它们的一般用途和安全特征。除非另外标注，杀菌剂的浓度用重量／体积（w/v）来表示。表3-1汇总了含氯消毒剂的推荐使用浓度。
表1 含氯消毒剂的推荐使用浓度

“清洁”情况下a
“污染”情况下b
所需的有效氯浓度
0.1%（1 g/L）
0.5%（5 g/L）
次氯酸钠溶液（含有5％的有效氯）
20 mL/L
100 mL/L
次氯酸钙（含有70％的有效氯）
1.4 g/L
7.0 g/L
二氯异氰尿酸钠粉剂（含60％的有效氯）
1.7 g/L
8.5 g/L
二氯异氰尿酸钠片剂（每片含1.5 g 有效氯）
每升1 片
每升4 片
氯胺（含有25％的有效氯）c
20 g/L
20 g/L
a 去除大部分污染材料后
b 溢流情况（如血液）或大量污染材料没有除去时
c 参见正文
氯（次氯酸钠）
1、氯属于快速作用的氧化剂，是一种可广泛应用的广谱化学杀菌剂。它一般以次氯酸钠（NaOCl）溶液来作为漂白剂销售。但氯的许多副产物可能对人体及环境有害，应该避免滥用含氯消毒剂，特别是漂白剂。
2、常规实验室消毒剂的有效氯浓度为1 g/L。处理生物危害性物质的溢出以及含有大量有机物的情况时用含有5 g/L 有效氯的更强作用的溶液。家用漂白剂的次氯酸钠溶液含有50 g/L 的有效氯，工业用漂白剂的次氯酸钠溶液含有近120 g/L 的有效氯，因此必须进行相应的稀释来达到工作浓度。
3、次氯酸钙［Ca（ClO）2］的颗粒或片剂一般含有70%的有效氯。用颗粒或片剂配制浓度1.4 g/L 或7.0 g/L 的溶液，其有效氯浓度分别为1 g/L 和5 g/L。
4、不建议将漂白剂当作防腐剂使用，但可以用作普通目的的消毒剂以及用于浸泡非金属类的污染材料。在紧急情况下也可以用终浓度含1～2 mg/L 有效氯的漂白剂来消毒饮用水。
5、氯气具有强毒性。因此漂白剂只能在通风良好的地方储存和使用。
6、漂白剂不能与酸混合以避免氯气快速释放。

乙醇
1、乙醇（C2H5OH）对于繁殖的细菌、真菌和含脂病毒具有活性，但不能灭活孢子，而对非含脂病毒的作用则不确定。
2、其水溶液最有效的使用浓度约为70％（v/v）；更高或更低的浓度均不适宜杀菌。
3、醇类溶液的主要优点是处理后物品不会留下任何残留物。
4、将乙醇与其他试剂混合使用比单独使用更有效，如70％（v/v）乙醇和100 g/L 的甲醛混合使用，以及使用含有2 g/L 有效氯的乙醇。
5、70%（v/v）乙醇溶液可以用于消毒皮肤、实验台和生物安全柜的工作台面，以及浸泡小的外科手术器械。
6、由于乙醇可以使皮肤干燥，所以经常与润滑剂混合使用。
7、在不便于或不可能进行彻底洗手的情况下，推荐使用含乙醇的擦手液对轻度污染的手进行消毒。但是必须记住，乙醇对孢子无效，而且不能杀死所有类型的非含脂类病毒。
8、乙醇是易挥发和易燃的，不能在明火附近使用。
9、其工作液应储存在适当的容器内以避免醇类挥发。
10、乙醇可以硬化橡胶并溶解某些胶质。
11、为了避免乙醇用于其他非灭菌目的，在实验室里对乙醇进行专门的清点和储存是非常重要的。
12、含有乙醇溶液的瓶子必须清楚标记以避免被意外高压灭菌。
碘和碘伏
1、这类消毒剂的作用与氯类似，只是有机质对它们的抑制作用略弱。
2、碘可以使纤维和环境表面着色，一般不适合作为消毒剂。但是，碘伏和碘酊是很好的抗菌剂。
3、多聚碘（polyvidone iodine）是一种安全可靠的外科手术擦手剂和手术前皮肤抗菌剂。
4、碘类抗菌剂一般不适于医疗／牙医器械的消毒。
5、碘不能在铝或铜上使用。
6、碘有毒性。含有有机碘的产品必须于4～10℃储存，以避免有潜在危害性的细菌在里面生长。
三、清除局部环境的污染
清除表面污染时使用次氯酸钠（NaOCl）溶液；含有1％有效氯的溶液适于普通的环境卫生设备，但是当处理高危环境时，建议使用高浓度（5 g/L）溶液。用于清除环境污染时，含有3％过氧化氢的溶液也可以作为漂白剂的
代用品。

四、洗手／清除手部污染
1、实验室人员需要经常地、彻底地洗手。
2、处理完生物危害性材料后以及离开实验室前均必须洗手。
3、大多数情况下，用普通的肥皂和水彻底冲洗对于清除手部污染就足够了。但在高度危险的情况下，建议使用杀菌肥皂。手要完全抹上肥皂，搓洗至少10 秒钟，用干净水冲洗后再用干净的纸巾或毛巾擦干。
4、应使用纸巾或毛巾来关上水龙头，以防止再度污染洗净的手。
5、如果没有条件彻底洗手或洗手不方便，应该用酒精擦手来清除双手的轻度污染。
五、高压灭菌
高压灭菌的湿热法是最常用、最为有效的清除病原体污染的物理手段。
灭菌后的物品必须小心操作并保存，以保证在使用之前不再被污染。
高压灭菌参数
对于大多数目的，下列组合可以确保正确装载的高压灭菌器的灭菌效果：
1、134℃、3min
2、126℃、10min
3、121℃、30min
4、115℃、45min
高压灭菌器的装载
为了利于蒸汽的渗透和空气排出，高压灭菌物品应松散包装放置在灭菌器内。要使蒸汽能够作用到其内容物。
高压灭菌器使用注意事项
1、应由受过良好培训的人员负责高压灭菌器的操作和日常维护。
2、由有资质人员定期检查灭菌器柜腔、门的密封性以及所有的仪表和控制器。
3、应使用饱和蒸汽，并且其中不含腐蚀性抑制剂或其他化学品，这些物质可能污染正在灭菌的物品。
4、所有要高压灭菌的物品都应放在空气能够排出并具有良好热渗透性的容器中；灭菌器柜腔装载要松散，以便蒸汽可以均匀作用于装载物。
5、当灭菌器内部加压时，互锁安全装置可以防止门被打开，而没有互锁装置的高压灭菌器，应当关闭主蒸汽阀并待温度下降到80℃以下时再打开门。
6、当高压灭菌液体时，由于取出液体时可能因过热而沸腾，故应采用慢排式设置。
7、即使温度下降到80℃以下，操作者打开门时也应当戴适当的手套和面罩来进行防护。
8、在进行高压灭菌效果的常规监测中，生物指示剂或热电偶计应置于每件高压灭菌物品的中心。最好在“最大”装载时用热偶计和记录仪进行定时监测，以确定灭菌程序是否恰当。
9、应当注意保证高压灭菌器的安全阀没有被高压灭菌物品中的纸等堵塞。
附录1
设备的安全性
仪器设备在使用时，有些操作可能造成微生物学危害，而另外一些操作或处理则是专门设计用来避免或减少生物学危害的。

表A1-1 可能产生危害的仪器设备及其操作
仪器
危害
如何消除或减少危害
皮下注射针头
意外接种、产生气溶胶或有害物质溢出
· 不要重新给针头戴护套或截断针头。

· 使用针头锁定型注射器以避免针头和注射器的分离，或使用针头和注射器为一体的一次性注射器。
· 采用规范的实验室技术，例如：
——注射器抽液时要小心，尽可能减少形成气泡和
接种物泡沫。
——避免用注射器来混合感染性液体；否则，要确
保针头的尖端伸入到容器中液面之下，并避免
用力过大。
——从有橡皮塞的瓶子中取下针头之前，应用经适
当消毒剂浸湿的脱脂棉来包裹针头和塞子。
——竖直向上将注射器中过量的液体和气泡排到
经适当消毒剂浸湿的脱脂棉或装有棉花的小
瓶中。
· 操作感染性物质时均应在生物安全柜中进行。
· 使用后要进行高压灭菌并确保进行了妥善处理。如果使用的是一次性针头和注射器，只有在高压灭菌后才能拆卸。
· 使用可封闭性的容器（安全杯）或密封转子。在气溶胶沉降后（30min）再打开容器或转子，或在生物安全柜中操作。
离心机

产生气溶胶、喷溅及离心管破裂
· 在离心机和真空泵之间安装HEPA 过滤器。
振荡器
产生气溶胶、泄漏和容器破裂
· 在打开匀浆器以前先等候30min 以使气溶胶沉
积。冷却以使气溶胶凝聚。

表A1-2 仪器设备相关事故的原因
事故
事故原因
减少或消除危害
设计或建造有缺陷

培养箱有电火花电击
没有温度过高断路装置
没有提供可靠的接地
· 符合国家标准
不适当使用

离心事故
转轴上的离心桶吊篮没有平衡
· 培训和监督工作人员
厌氧培养箱爆炸
不正确使用气体
· 培训和监督工作人员
不正确配用

家用型冰箱爆炸
危险性化学品没有储存在防火∕防爆容器中，如用渗漏的螺旋瓶盖储存乙醚。
· 低闪点溶剂和提取物仅贮存在具有火花∕爆炸保护装置的冰箱或安全柜中。

表A1-3 生物安全设备
设备
避免的危害
安全性特征
生物安全柜

——Ⅰ级
气溶胶和喷溅
· 尽量减小工作入口处向内的气流（正面气流速度）；排风经充分过滤
· 不能保护操作对象
——Ⅱ级
气溶胶和喷溅
· 尽量减小工作窗口处向内的气流（正面气流速度）；排风经充分过滤
· 可以保护操作对象
——Ⅲ级
气溶胶和喷溅
· 最高防护
· 如果内部为层流气流，则可以保护操作对象
移液辅助器
由于口吸产生的危害，例如病原体的食入、吸入用口抽吸吸管时所生成的气溶胶、从吸管中吹出或滴出液体、吸管吸入端的污染等
· 便于使用
· 控制吸管吸入端的污染，保护移液辅助器、操作者和真空管道
· 可以灭菌
· 控制吸管尖端的泄漏
微型接种环加热器、一次性接种环
移动接种环时造成的喷溅
· 遮护玻璃管或陶瓷管的开口端，采用气体或电加热
· 一次性的，不需加热
设 施 内 用 于收集并运送感染性物质进行灭菌的防漏容器
产生气溶胶、溢出和泄漏
· 有罩或盖子的防漏结构
· 耐用
· 耐高压灭菌
盛放锐器的一次性容器
意外刺伤
· 耐高压灭菌
· 坚固，不易刺破
实验室和单位间运送物品的容器
微生物泄漏
· 坚固
· 能盛放溢出物的防水性一级和二级容器
· 用于吸收溢出物的材料
手动或自动的高压灭菌器
感染性物质（以保证丢弃或重复使用时的安全）
· 经批准的设计
· 有效的加热灭菌
螺口盖的瓶子
产生气溶胶和泄漏
· 有效的防护

表A1-4 个体防护装备
装备
避免的危害
安全性特征
实验服、隔离衣、连体衣
污染衣服
· 背面开口
· 罩在日常服装外
鞋袜
碰撞和喷溅
· 不露脚趾
护目镜
碰撞和喷溅
· 防碰撞镜片（必须有视力校正或外戴视力校正眼镜）
· 侧面有护罩
N95口罩
碰撞和喷溅
· 罩住面部
· 发生意外时易于取下
手套
直接接触微生物划破
· 得到微生物学认可的一次性乳胶、乙烯树脂或聚腈类材料
· 保护手
· 网孔结构

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