微生物制药.doc

第一章 药物微生物与微生物药物
什么是微生物药物（Microbial Medicines）
狭义定义为：微生物在其生命过程中产生的，能以极低浓度有选择地抑制或影响其他生物机能的低分子的代谢物。
广义定义为：能以极低浓度抑制或影响其它生物机能的微生物或微生物的代谢物。
三、微生物发酵制药的种类 （1）微生物菌体发酵（2）微生物酶发酵（3）微生物代谢产物发酵（4）微生物转化发酵
一、药物微生物分类 药源微生物：药用微生物：基因工程菌：
二、 微生物作为天然药物资源的优势
① 微生物多样性 ② 生长快速，可以大规模工业化生产 ③ 微生物遗传背景简单
④ 微生物代谢产物的多样性为筛选高效低毒的药物提供了可能性。
三、药源微生物
不同的微生物类群，次级代谢产物的形成能力有着巨大的差异。甚至是产生药物较多的种属之间，产物的类型也有着巨大的差异。只有少数的微生物类群是优秀的药物产生菌---药源微生物。因此，药源微生物是药物筛选最重要的来源。
半个多世纪的微生物药物的筛选与开发，为人们提供了大量的各种类型天然化合物，占全部发现的生物活性天然化合物的80%以上。在微生物来源的天然化合物中，70%左右是由放线菌产生的，尤其是链霉菌。但随着筛选工作广泛深入的开展，从放线菌获得新化合物的比例已经降到了不足0.1%。因此，目前微生物药物的筛选已从传统的高产微生物转向新的微生物类群。如中药用微生物、海洋微生物、极端微生物、以及尚未开发或开发不足的新微生物类群。
如下微生物类群，通常都有着或多或少的“光荣的”药物产生历史。
（1）放线菌：目前国际上已经描述和发表的放线菌近60个属，2000多种，放线菌是产生微生物药物最多，也是药物研究最多的生物类群。最重要的是产生链霉素的链霉菌属（Streptomyces），其次是产生放线菌素和庆大霉素的小单孢菌属（Micromonospora），产生利福霉素的诺卡氏菌属（Nocardia）。
（2）细菌：芽胞杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas），产生的主要是肽类，毒性较大，但通过组合生物合成技术，可能经过人工改造获得新型的药物。值得一提的是目前研究较热的粘细菌（Myxobacteria），重要的药源菌类群。例如能够降解纤维素的纤维堆囊菌，是目前已知的产生生物活性代谢产物的比例最高的生物类群，并且产物结构新颖多样，是很好的药源菌类群。
粘细菌又称子实粘细菌，其生活史包括营养细胞阶段和休眠体（子实体）阶段。营养细胞杆状，包埋在粘液层中，菌体柔软，除缺乏坚硬的细胞壁外，与G-细菌无甚差别。在固体表面或气-液界面滑动。以二横裂方式繁殖。营养细胞发育到一定阶段，在一定位置聚集，并形成由细胞和粘液组成的子实体，肉眼可见。在子实体中细胞变成休眠细胞，称为粘孢子。
（3）真菌：重要的药源真菌主要是青霉属（Penicillium），曲霉属（Aspergillus），头孢菌属（Cephalosporium）的菌株。 传统中药中的大型真菌，如灵芝、虫草等，被称为药用真菌。现代研究表明，药用真菌也是通过产生具有药理活性的代谢产物而起作用，如大分子多糖、小分子萜类、多肽等。
五、药用微生物
（1）传统中药（汉药方）大型药用真菌，如灵芝、虫草。（2）粘细菌的子实体结构部分
（3）各种具有明显药效作用的菌剂，如减毒或灭活的疫苗、益肠道菌剂、农用微生物菌剂。
四、次级代谢产物合成的特点
① 次级代谢产物多在细胞停止生长以后合成② 初级代谢产物可直接或修饰后成为次级代谢产物合成的前体。
③ 合成反应包括聚合作用和修饰④ 次级代谢产物分泌胞外⑤ 合成反应受初级代谢影响间接松弛，主要受次级代谢自身系统控制。
六、次要组分
大部分微生物通常能够产生一系列密切相关的次级代谢产物，其中仅有一种或两种是主要的，其余的都是微量组分，这些微量组分即称为次要组分。
在已知的药源微生物中发现未知的次要组分的例子很多，如白霉素、制霉菌素、多粘菌素等 。
次要组分的实际重要性时非常大的，如头孢霉素C、卡那霉素B的发现。
次要组分多数是主要产物的结构类似物，少数呈现不同结构
七、微生物药物的几个相关概念
（7）化疗指数（chemotherapeutic index，CI）判断一种药物的安全性和有效性的综合指标。
CI=
治疗对象对药物不呈现明显毒性反应的最大耐受剂量
明显疗效的最低给药剂量

一般以动物半数致死量（LD50）和治疗感染动物的半数有效量（effective dose, ED50）的比值表示，即CI＝LD50/ED50；化疗指数愈大，表明药物毒性愈小，相对较安全，但并非绝对安全，如化疗指数高的青霉素可致过敏性休克。
（10）药物相互作用
不同药物同时存在时，将会对各自的活性产生相互的影响。累加作用：相互无关 协同作用：相互促进 拮抗作用：相互抑制
十一、微生物药物的应用
1.治疗疾病 选用药物时应考虑如下几个方面的因素。（1）抑菌谱（2）毒副作用（3）药代动力学（4）流行病学和耐药性（5）联合用药
2.预防疾病 预防性使用药物时应注意：（1）用于极可能会出现感染的情况（2）正确选择（3）给药时间
3、兽医药中的应用 群体治疗有以下优势：① 同时治疗所有动物，阻断了感染源；② 对那些传染期无传染症状或有传染前症状的动物加以治疗，不影响动物的经济价值；③ 通过饮食给药简便且易于控制。但群体治疗也有不利之处：① 很难准确掌握对个体的药物剂量；② 饲料拌药的形式、周期、技术等方面困难。
4、改善畜牧业产品的生产 抗生素影响动物生长的可能机制是：① 抑制产毒素的肠道细菌；② 抑制无症状致病菌；③ 抑制食物中的有害菌；④ 通过抑制有害菌的生长而促进有益菌的生长。
5、在农业上的应用 ① 抑制植物致病细菌感染。② 控制植物致病真菌感染。③ 除草剂。
6、作为研究工具① 细胞代谢中生物分子功能的阐明。；② 绘制微生物遗传图谱。③遗传操作。
重要的药源微生物类群
一、放线菌 二、芽孢杆菌属 三、假单胞菌属 四、粘细菌 五、曲霉菌属和青霉菌属 六、海洋微生物 七、极端微生物
药物微生物的筛选样品的采集要考虑以下因素
1、环境中有机质的含量及种类 2、采集季节 3、含水量 4、酸碱度
药物微生物的筛选技术
一、样品的采集 二、微生物的分离 三、发酵 四、活性测定 五、化合物的分离纯化 六、产物结构鉴定 七、微生物鉴定
二、发酵条件的选择
发酵环境的改变通常会造成微生物次级代谢产物合成的改变。这些改变既包括产量的改变，也包括活性成分组分的改变；既有出现时间的改变，也有一些已产生的物质的消失或出现新成分等。
1、发酵培养基营养物质的选择 为发酵培养基选择合适的营养物质需要对微生物合成产物的条件进行细致地分析。发酵培养基包括碳源、氮源、无机金属离子和缓冲剂等。复杂的培养基更适于次级代谢产物的合成，因为它们不但可以获得更高的产量，并且也更经济。化学成分很清楚的合成培养基在微生物次级代谢产物的发酵中很少使用。
2、含高浓度磷酸盐的培养基 尽管低浓度的磷酸盐培养基有利于次级发酵代谢产物的合成这一观点被广泛接受，但是含有1%-2%无机磷酸盐的高浓度磷酸盐培养基也被成功地用于发酵生产硝吡咯菌素。
3、含高浓度其他盐的培养基 鉴于无机磷酸盐对微生物次级代谢产物的生物合成的普遍抑制作用已被充分证明，所以高浓度磷酸盐培养基被认为是一种极端的发酵条件。同样，高浓度的其他盐也可能形成这种有利于次级代谢产物合成的极端发酵条件。
4、pH碱性的培养基 有些微生物可以在pH碱性条件下生长，并产生碱性胞外酶。许多放线菌和真菌属于这类嗜碱微生物，在碱性条件下这类菌可产生新的次级代谢产物。
5、拟混合培养 通过两种微生物的混合培养来获得新的化合物的实验室令人感兴趣的。可能期望一株菌产生了一种生物学上没有活性的代谢物，这种代谢物可以被第二株菌变成有活性的化合物。
6、前体指导的生物合成 次级代谢过程中的酶常常表现出较低的底物专一性，合成的次级代谢产物通常是一大类结构相似的代谢物。因此，添加一定的外源前体可以获得所需产物的特定组分。
第二节 筛选模型 目前的筛选模型可以从筛选水平上分为三类：体外细胞水平、体外靶分子水平和体内动物实验。
一、体外细胞筛选模型
1、超敏感细胞筛选模型 2、β-内酰胺类化合物细胞筛选模型 3、β-内酰胺酶抑制剂细胞筛选模型
4、作用于细胞壁合成的药物学筛选模型 5、细胞膜抑制剂的筛选模型 6、抗代谢物筛选模型
二、体外分子筛选模型
1、抗生素钝化酶靶分子模型 2、受体靶分子模型 3、正常酶靶分子模型 4、cccDNA（共价闭合环状DNA）靶分子模型
化学筛选的原则 1、首先是使用几个特殊的实验对代谢产物进行分离和检测，包括颜色反应鉴定代谢产物中的代表性官能团；
2、再对已分离的代谢产物的生物活性进行估计。
影响次级代谢产物合成的因素
1、营养因素2、金属离子3、前体物质4、胞内诱导物5、pH 6、温度7、通气和搅拌8、渗透压

第三章 微生物药物的发酵生产技术
一、 工业生产菌株的诱变筛选及基因改造
（一） 自然选育
基本过程如下：菌种→单孢子或单细胞悬液→适当稀释→琼脂平板分离→挑单个菌落进行生产能力测定→选出优良菌株。
（二）诱变育种
诱变育种方案的设计
诱变育种整个过程涉及诱变和筛选两个阶段，甚至是不断多轮重复。首先制定诱变方案，进行诱变实验。其次，确定筛选目标和方案，进行筛选。
（三）杂交育种 杂交育种是两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选具有新性状的菌株，带有定向育种的性质
（四）基因工程技术育种 基因组shuffling技术 DNA shuffling
药物生产菌的营养需求
1、碳源 2、氮源 3、无机盐和微量元素 4、水 5、生长因子 6、前体与促进剂 7、 消沫剂
三、发酵培养基的配制
1、一般原则（1）生物学原则（2）工艺原则（3）低成本原则（4）高效经济原则
2、培养基的设计基本思路
（1）根据他人的经验和成分，初步确定培养基的成分，作为研究的起始培养基。（2）单因素实验，确定最适宜的培养基成分。
（3）多因素实验，进行各成分之间浓度优化和最佳配比。如均匀设计、正交实验和响应面分析等统计学方法。
（4）从摇瓶、小型发酵罐，到中试，最后放大到生产罐。（5）综合考虑各种因素，产量、纯度、成本等后，确定一个适宜的生产配方。
什么是微生物制药？微生物制药基本过程
利用药物微生物，通过发酵培养，在一定条件下，生长繁殖，同时在代谢过程中产生药物，然后，从发酵液中提取分离、纯化精制，获得药品。菌株选育、发酵、分离纯化和成品检验与包装是发酵制药的四个主要阶段。
建立分离纯化工艺的依据
1、起始物料的特点，包括：
（1）菌种类型及其代谢特性（2）原材料和培养基的来源及其质量（3）生产工艺和条件（4）初始物料的物理、化学和生物学特性
2、物料中杂质的种类和性质 3、目的产物 4、产品质量的要求
二、分离纯化的基本过程 1、发酵液的预处理和固液分离 2、分离浓缩 3、精制
分离纯化技术应满足下列要求：
（1）技术条件要温 （2）选择性要好（3）收率要高（4）两个技术之间要能直接衔接（5）整个分离纯化过程要快
三、分离纯化的技术 1、细胞破碎与固液分离 2、目的产物的分离纯化 3、非蛋白质类杂质的去除
第四章 抗生素及耐药性
抗生素是生物包括微生物、动物、植物在其生命活动的过程中所产生的（或化学方法合成的），能在低浓度下有选择地抑制或影响其他生物机能的有机物质。
二、抗生素的发展历程
1、第一阶段---抗生素时代的开创
青霉素的发现者英国人弗莱明Fleming-----染菌事件 弗莱明的结果发表于1929年，但是起初并未引起高度的重视。弗莱明指出青霉素将会有重要的用途，但是他自己无法发明一种提纯青霉素的技术，致使这种灵丹妙药十几年一直未得以使用。
第二次世界大战初期人们在寻找新的抗感染药物过程中，在查阅文献资料时再次发现弗莱明的学术论文，于是这一现象重现获得研究。
1940年英国牛津大学病理学教授弗罗里和生化专家钱恩组成的研究小组成功的研制出从青霉素培养液中提取出青霉素的方法。弗罗里用纯度不到5%的粗品对小白鼠进行化疗试验，试验获得了惊人的成功，随后对人体试验也获得了成功，出现了世界上第一个有临床价值的抗生素。由于青霉素对人类的巨大贡献，1945年弗莱明、弗洛里、钱恩共享诺贝尔生理医学奖。
2、第二阶段---抗生素发展的黄金时代
抗生素大规模筛选时代从瓦克斯曼的工作开始 4年，瓦克斯曼Waksman从灰色链霉菌的代谢产物中发现了能够有效治疗肺结核的链霉素。由于链霉素有效地克服了当时的顽病--结核病，振救了无数人的生命，因而获得1952年诺贝尔生理医学奖。
瓦克斯曼用链霉素和新霉素赚到的巨款建立了举世闻名的瓦克斯曼微生物研究所。他的最大贡献是系统的探讨了土壤中的拮抗微生物，指出放线菌作为抗生素来源的巨大潜力，并且建立了一整套筛选方法。他是当之无愧的抗生素研究的先驱者。
抗生素的黄金时代是在链霉素发现之后形成的。1947-氯霉素，1948-金霉素，1951-红霉素。青霉素、链霉素、四环素和氯霉素是五十年代抗生素的支柱产品。50-60年代最突出的抗生素是1957年发现的卡那霉素和1963年发现的庆大霉素。在这二十多年里，每年有关新抗生素的报道不下百种。
3、第三阶段---半合成抗生素时代
（1）半合成抗生素发展的必要性六十年代后期, 从土壤中筛选到新的、有用的抗生素的比率越来越小；微生物对抗生素的耐药性越来越显著，因而寻找新抗生素的速度开始变慢。取代的是半合成抗生素的出现，即对原有抗生素根据构效关系进行结构改造以寻求具有更好临床效果的新衍生物，这是抗生素发展到六十年代出现的新领域。通过结构改造可以克服病原微生物的耐药性、扩大抗菌谱、减少副作用、改善药代动力学性质等以改善抗生素疗效。
（2）半合成抗生素的发展首先是半合成青霉素的发展
1959年钱恩利用大肠杆菌酰胺酶裂解青霉素G制成了6-APA（6-氨基青霉烷酸）。以6-氨基青霉烷酸为母体合成了耐青霉素酶的甲氧西林、苯唑西林、氟氯西林，接着合成了抗菌谱广的氨苄青霉素、阿莫西林以及抗假单胞菌的羧苄西林、磺苄西林、阿洛西林等。
（3）半合成头孢菌素的出现把半合成抗生素推向了高潮
牛津大学的学者从一株头孢菌中分离到另两种甾醇类抗生素头孢菌素C和一种新型青霉素-青霉素N 。当时产青霉素酶而使青霉素失活的葡萄球菌已成为主要问题。而头孢菌素 C对青霉素酶不敏感。这个发现立即表明头孢菌素C比青霉素更具优势，它对G-菌和产青霉素酶的金黄色葡萄球菌都具有活性，而且它的毒性极弱。
（4）其他类抗生素的结构改造也得到长足发展
氨基环醇类：卡那霉素→阿米卡星、地贝卡星 庆大霉素→异帕米星
大环内酯类：红霉素→阿奇霉素、克拉霉素 旋霉素→乙酰螺旋霉素
安莎类：利福霉素→利福平
四环素类： 四环素→多西环素、米诺环素
引起青霉素过敏反应的原因：内含不稳定的β-内酰胺环，水溶液不稳定，可以发生降解反应和聚合反应。降解反应：生成青霉噻唑酸、青霉烯酸等降解产物。聚合反应：青霉素C或6-APA生成高分子聚合物。这些具有致敏性的反应产物（半抗原）与体内蛋白质结合形成抗原，引起变态反应。
、抗生素的生产方法
1、生物合成法即微生物发酵法，是利用特定的微生物，在一定的条件下（培养基、温度、pH、通气、搅拌等）使之生长繁殖，并在代谢过程中分泌出来抗生素。然后利用抗生素的特定理化性质，并选用适当的化学手段将抗生素从发酵产物中分离出来，加以提取和精制，最后获得符合药典规定的各种抗生素产品。
抗生素生产的工艺过程：
菌种---孢子制备---种子制备---发酵---发酵液预处理及过滤---提取---精制---成品检验---成品包装---出厂检验
2、全化学合成法
优点：效率较高，受影响因素少。克服了发酵法生产的缺点。缺点：导致的环境污染问题严重。
3、半化学合成法
半合成法，就是用化学或生物化学的方法改变已知抗生素的化学结构，或引入特定的功能基团而获得新的抗生素品种或衍生物的方法。
一般分两个阶段进行：第一阶段是通过生物合成法来制取某种抗生素；第二阶段是将已制得的天然抗生素，通过化学方法改变其原有的化学结构，从而获得一种新的抗生素。
半合成抗生素的目的：增强抗菌能力；扩大抗菌谱；对耐药菌有效；便于口服；降低毒副作用或弥补其他缺陷。
生物法合成抗生素的过程
生产菌种 孢子制备 种子制备 发酵 发酵液的预处理 提取和精制 成品检验 成品的分装、包装
抗生素的作用机制
一、影响细胞壁的合成
影响细胞壁合成的抗生素，实际上就是抑制肽聚糖的合成。并作用于肽聚糖合成的不同环节。1、抑制生物合成酶2、与载体分子结合3、与作用底物结合等。
二、影响细胞膜的功能
抗生素均可以改变细胞膜的通透性，但作用机制不同。1、影响细胞膜的结构2、与细胞膜的成分结合3、作为离子导体
三、抑制核酸的生物合成1、影响DNA模板功能2、抑制RNA合成的抗生素
四、抑制蛋白质合成的抗生素1、抑制蛋白质合成的起始过程2、抑制蛋白质合成的延长过程 3.制转肽反应
五、影响细胞的能量代谢
1、三羧酸循环 2、通过呼吸链的电子传递系统3、由电子传递引起的能量转移
耐受性（tolerance）：重复用药能够降低机体对某些药物的敏感性。在人和动物反复用药时发生的敏感性降低的现象称为耐受性。
耐药性 物和肿瘤细胞多次与药物接触时发生的敏感性降低的现象称为耐药性。
交叉耐药性：病原菌对某种抗菌药物产生耐药性的同时，对其他作用机制类似的抗菌药物也产生耐药性的现象称为交叉耐药性。
多剂耐药性：病原菌可同时对多种作用机制不同的抗生素产生耐药性，成为多剂耐药性。
二、细菌耐药性的分类
1、固有耐药性：指细菌对某些抗菌药物天然不敏感。 与种属有关，主要是缺乏药物作用的靶位。
2、获得耐药性： 由于DNA的改变使其获得耐药性。 原因：（1）基因突变 （2）质粒介导的耐药性 （3）转座因子介导的耐药性
三、耐药性的遗传机制
1、耐药菌的产生
遗传学试验证明，自然界中敏感菌群在没有与药物接触到的情况下，经常有少数敏感菌自发突变为耐药菌，但是自发突变频率很低，一般在10-10-10-5之间。但在抗菌药物作用下，敏感菌逐渐被抑制或杀死，耐药菌趁机生长繁殖，被选择出来，形成耐药菌群。所以认为自然界耐药菌的产生是自发突变和选择的结果。
2、耐药性的产生
控制细菌耐药性的基因突变既可以发生在染色体遗传基因上，也可以发生在染色体外的遗传基因上。因此，从遗传角度上可将细菌耐药性分为染色体遗传基因决定的耐药性和染色体外的遗传基因决定的耐药性。前者称为染色体性的耐药性，后者称为染色体外的耐药性或质体耐药性。
在自然界中发生染色体耐药性的几率很低，在临床上这类耐药性可在金黄色葡萄球菌和肠道杆菌中通过转导的方式而产生；染色体外耐药性是通过耐药性质粒（R质粒）以接合的方式转移到敏感菌中，可转移多种耐药信息。
四、耐药性的生化机制
1、产生使抗生素失去活性的酶
（1）青霉素和头孢菌素耐药菌---β-内酰胺酶（2）氯霉素耐药性菌---氯霉素乙酰转移酶
（3）氨基糖苷类抗生素耐药菌---乙酰转移酶、磷酸转移酶、腺苷转移酶（4）甲基化酶
2、改变抗生素作用部位的结构
大环内酯类抗生素的耐药菌是由于核蛋白体50S亚基的蛋白质发生变化，与抗生素结合的亲和力降低，或者是由于抗生素与50S亚基中的23S的RNA上的腺嘌呤发生甲基化，致使核蛋白的立体结构发生改变，与抗生素结合障碍。
利福霉素耐药性细菌是由于作用部位RNA聚合酶的β-亚基发生变化，使得核心酶不能与抗生素结合，降低了对抗生素的敏感性。
3、改变细胞膜对抗生素的通透性
对四环素耐药的革兰氏阳性菌和阴性菌由于转运四环素的系统被抑制，使四环素不易进入耐药性细菌的细胞膜内。
五、耐药性控制策略
1、合理使用抗菌药物 2、严格执行消毒隔离制度 3、加强药政管理 4、新抗生素和质粒消除剂的研制 总之，控制耐药性是一项综合性强、难度大、涉及面广的工作，需不懈努力。
第六章 疫苗
一、 什么是疫苗？ 疫苗（vaccine）是一种通过抗原诱发机体产生特异性免疫反应以预防和治疗疾病或达到特定医学目的的生物制剂。
疫苗的作用机制
抗原进入机体后，由抗原递呈细胞（APC）通过两条不同的途径递呈给免疫效应细胞。
第一条途径：外部抗原通过与主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complex,MHC）结合后，递呈给CD4+T淋巴细胞，进而刺激B淋巴细胞增殖，分化成浆细胞，产生特异性抗体。
第二条途径：在机体被感染或接种疫苗后，细胞内生成的内生性抗原与细胞质中的MHCⅠ类分子结合，递呈给CD8+T淋巴细胞，产生特异性细胞毒T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞，产生细胞免疫；同时内生性抗原递呈给CD4+T淋巴细胞，产生体液免疫。
疫苗种类
活体疫苗： 能够在宿主或感染细胞中繁殖的微生物构成的疫苗。亚单位疫苗或灭活疫苗：在宿主内不能复制的免疫原。
核酸疫苗：由核酸直接构成的疫苗，在细胞中可以表达出疫苗抗原。
一 活体疫苗（live vaccine）：由微生物（通常是病毒构成），经过物理化学或生物学方法处理后，其致病能力被去除，保留了病毒或细菌的复制生长能力和免疫原性，能够同时引起体液免疫和细胞免疫。
1、体外减毒疫苗病毒或细菌经过多代繁殖，毒性会大大衰减，然后用毒性衰减后的病毒或细菌使人体产生抗体，这就是减毒疫苗。
2、温度敏感突变疫苗温度敏感突变株(ts株)为病毒的一种突变形式。其特点是病毒突变后在较低温度下能够繁殖，但在较高温度下不能够繁殖。ts突变株常为减毒株，用于病毒遗传学研究及制备疫苗。
3、变种疫苗 其他物种的变种病毒能够引起与人类疾病相似的病症，但对人类的致病性变弱，同时能够引起人类对该病毒的保护性免疫反应。
4、重配疫苗 重配病毒是来源于两种不同病毒基因组片断的共感染。如重配轮状病毒，大部分基因是动物轮状病毒基因，对人类的表型相对较弱，同时存在编码人类轮状病毒表面蛋白基因，决定了重配轮状病毒感染后的产生的抗体的特定立体结构，从而抵御了轮状病毒的感染。比未重配的动物轮状病毒效率更高。
5、重组疫苗 将毒株基因进行特定的修饰或缺失，使毒性稳定地减弱，保证不能恢复毒力
二 灭活疫苗（non-live vaccine）: 死的毒株，在人体内不能繁殖，只保留免疫原性。
1、灭活全细菌疫苗 2、灭活全病毒疫苗
三、亚单位疫苗 去除病原体中与激发保护性免疫无关的甚至有害的成分，保留有效免疫原成分制作的疫苗。
1基于蛋白的亚单位疫苗
由天然蛋白制备亚单位疫苗 化学灭活制备蛋白疫苗 基因灭活制备蛋白疫苗 利用重组蛋白制备疫苗
2基于肽的亚单位疫苗
融合蛋白亚单位疫苗 共轭肽类亚单位疫苗 T淋巴细胞抗原决定簇疫苗
3以多糖为基础的亚单位疫苗 简单多糖疫苗 共轭结合多糖疫苗
4抗独特型疫苗 指使用与特定抗原的免疫原性相近的抗-抗体为抗原制备的疫苗，处于理论研究阶段。
四、核酸疫苗
1、核酸疫苗：又叫基因疫苗，使用能够表达抗原蛋白的基因即核酸制成的疫苗。
3、 核酸疫苗的优点
（1）免疫保护力增强（2）制备简单，省时省力（3）同种异株交叉保护（4） 应用较安全（5）产生持久免疫应答
 （6）贮存、运输方便（7）可用于防治肿瘤
五、疫苗佐剂
药物佐剂：某种可以加强药物疗效的物质。
免疫佐剂：能加强抗原的免疫原性和免疫保护效果的物质。
免疫佐剂的生物作用包括：
（1）抗原物质混合佐剂注入机体后，改变了抗原的物理性状，可使抗原物质缓慢地释放，延长了抗原的作用时间；
（2）佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；
（3）佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；
（4）佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作用；
（5）可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原；
（6）可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴变；
（7）改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。
第七章 基因工程药物
一、基因工程药物（Genetic engineering drugs）
指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白合成过程的基因分离、纯化或进行人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最后将该基因放入可以大量生产的受体菌中不断繁殖，并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质，通过这种方法生产的药物称为基因工程药物。
四、为什么要发展基因工程药物？
1、材料来源困难； 2、制造技术问题； 3、含量太低、成本太高，使其应用受到限制； 4、在提取过程中可能造成药物被病毒感染、制造的药物会对病人产生严重后果； 5、非人源蛋白质，长期使用会产生免疫反应。
五、利用基因工程技术生产药物的优点
1、大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障；
2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；
3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；
4、内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；
5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
基因工程药物立项研究需要考虑的问题
1、目的和意义（1）开发新药还是仿制（已有国家标准）？创新药物？是几类药？ （2）开发目标？实验室研究？正式受理？临床批件？新药证书？生产批件？为什么？有什么社会与经济意义？
2、 国内外研发现状（！）有人研究吗？所处的研发阶段？（2）研究开发现状综述（3）知识产权状况
3、 主要研究内容、技术路线与方法（1）主要研究内容（2）技术路线与方法。
4、 技术风险分析（1）已有研究基础（2）技术难点与要解决的关键问题
5、 财务分析（1）市场分析（2）投资风险分析（3）资金筹措
基因工程菌的构建
一、获得目的药物基因 1、cDNA文库获得2、直接从特定的mRNA分离基因3、化学合成法
二、表达载体的选择
1、载体能够独立复制，有复制起点。
2、灵活的克隆位点和方便的筛选标记，利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。
3、有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶所识别。
4、有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。
5、有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。
6、产生的mRNA必须有翻译的起始信号
三、构建重组质粒 四、选择合适的宿主细胞
菌体宿主细胞应满足的条件
（1）容易获得较高浓度的菌体；
（2）能利用廉价易得的原料；
（3）不致病、不产生内毒素；
（4）发热量低、需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；
（5）容易进行代谢调控；
（6）容易进行DNA重组技术操作；
（7）产物的产量、产率高，产物容易提取。
五、构建基因工程菌
六、筛选重组子 七、基因工程菌鉴定与分析1、质粒与表达盒鉴定2、细胞基质鉴定3、工程菌传代稳定性分析
基因工程菌的发酵工艺考虑的因素
1、培养基的影响
2、接种量的影响 大接种量有利于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但接种量过高又会抑制后期菌体的生长。接种量小，不利于外源基因的表达；
3、温度的影响 温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成水平上。在复制水平上，可通过调控复制，改变基因拷贝数，影响基因表达；在转录水平上，可通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，来调控基因表达；温度也可在mRNA降解和翻译水平上影响基因表达，温度还可能通过细胞内小分子调节分子的量而影响基因表达，也可通过影响细胞内ppGpp量调控一系列基因表达。温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成
4、溶解氧的影响 溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。
5、pH的影响 pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。
总之，工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大，必须建立最佳化工艺。

基因工程药物的质量控制
一、菌种的质量控制
菌种的质量控制是要确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。
二、培养过程的质量控制
在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。
三、纯化工艺过程的质量控制
产品要有足够的生理和生物学试验数据，确保提纯物分子批间保持一致；外源性蛋白质、DNA与热原都控制在规定限度下。
四、目标产品的质量控制
基因工程药物质量控制主要包括以下几项要求：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。
1、产品的鉴别
（1）肽图分析（2）氨基酸成分分析（3）部分氨基酸序列分析（4）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定(5) 蛋白质二硫键分析
2、纯度分析 纯度分析是基因工程药物质量控制的关键项目，它包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析两个方面的内容。
3、生物活性测定 需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。
4、稳定性考察 5、产品一致性的保证
五、产品的保存
1、液态保存（1）低温保存（2）在稳定pH条件下保存（3）高浓度保存（4）加保护剂保存
2、固态保存