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选修1《生物技术实践》一轮复习知识梳理
专题1 传统发酵技术的应用
课题1 果酒和果醋的制作
【补充知识】发酵
1、概念：利用微生物或其他生物的细胞在有氧或无氧条件下繁殖或积累其代谢产物的过程。
2、类型：
（1）根据是否需要氧气分为：需氧发酵和厌氧发酵。
（2）根据产生的产物可分为：酒精发酵、乳酸发酵、醋酸发酵等。
一、基础知识
（一）果酒制作的原理
酶
酶
1．菌种是 酵母菌，属于真核生物，新陈代谢类型异养兼性厌氧型，
有氧时，进行有氧呼吸，大量繁殖，反应式为：C6H12O6+6H2O+6O2 → 6CO2+12H2O+能量；无氧时，能进行酒精发酵，反应式为：C6H12O6 → 2C2H5OH+2CO2+能量。
2．酵母菌繁殖的最适温度20℃左右，酒精发酵一般控制在18～25℃。
3．自然发酵过程中，起作用的主要是附着于葡萄皮上的野生型酵母菌。也可以在果汁中加入人工培养的酵母菌。
（二）果醋制作的原理
1．菌种是醋酸菌，属于原核生物，新陈代谢类型为异养需氧型。只有在氧气充足时，才能进行旺盛的生命活动。变酸的酒表面观察到的菌膜就是醋酸菌在液面大量繁殖形成的。
酶
2．当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸，
当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，
反应简式为C2H5OH+O2 → CH3COOH+H2O。
3．醋酸菌的最适合生长温度为30～35℃。
4．菌种来源：到生产食醋的工厂或菌种保藏中心购买，或从食醋中分离醋酸菌。
二、实验设计
1、流程图
挑选葡萄 冲洗 榨汁 酒精发酵 醋酸发酵

果酒 果醋
2、装置：充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；
排气口 是在酒精发酵时用来排出二氧化碳的；排气口要
通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接，其目的
是防止空气中微生物的污染。开口向下的目的是
有利于二氧化碳的排出。·使用该装置制酒时，应
该关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入 氧气。
出料口是用来取样的。·
三、课题延伸
果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。
检测时，先在试管中加入发酵液2mL，再滴入物质的量的浓度为3mol/L的H2SO43滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴。
【教材答案】
（一）旁栏思考题
1.你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？
答：应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。
2.你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？
提示：需要从发酵制作的过程进行全面的考虑。例如，榨汁机、发酵装置要清洗干净；每次排气时只需拧松瓶盖、不要完全揭开瓶盖等。
3.制葡萄酒时，为什么要将温度控制在18～25 ℃？制葡萄醋时，为什么要将温度控制在30～35 ℃？
答：温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20 ℃左右最适合酵母菌繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度范围内。而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为30～35 ℃，因此要将温度控制在30～35 ℃。
4.制葡萄醋时，为什么要适时通过充气口充气？
答：醋酸菌是好氧菌，在将酒精变为醋酸时需要氧的参与，因此要适时向发酵液中充气。
课题2 腐乳的制作
一、基础知识
腐乳制作的原理
1．腐乳的发酵有多种微生物的协同作用，其中起主要作用的是毛霉，它是一种真核生物，新陈代谢类型是异养需氧型。
2．毛霉等微生物产生的蛋白酶可以将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可以将脂肪水解成甘油和脂肪酸。
3．现代的腐乳生产是在严格的无菌条件下，将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免其他菌种的污染，保证产品的质量。
4.条件控制： 温度：控制在15~18°C，，并保持一定的湿度。
二、实验设计
1、实验流程
让豆腐长出毛霉→加盐腌制→加乳汤装瓶→密封腌制。
3~5天 8天
【教材答案】
（一）旁栏思考题
1.你能利用所学的生物学知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事？
答：豆腐上生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。
2.王致和为什么要撒许多盐，将长毛的豆腐腌起来？
答：盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。
3.我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？
答：含水量为70%左右的豆腐适于作腐乳。用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形。
4.吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是怎样形成的呢？它对人体有害吗？它的作用是什么？
答：“皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。“皮”对人体无害。
课题三 制作泡菜
一、 制作原理
1、微生物是乳酸菌 ，其代谢类型是异养厌氧型。
2、原理：在无氧条件下，将糖分解为乳酸 （乳酸发酵）
反应式为：C6H12O62C3H6O3+能量
3、分裂方式是二分裂。
专题二 微生物的培养与应用

课题一 微生物的实验室培养
一、培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。
1、种类·培养基按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。
·按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。
·按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。
选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。
鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。
2、、化学成分包括 ：水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源（有些可加生长因子、维生素）等。
·碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。
·氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）、蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。
·培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件。
3、配置原则
（1）目的明确：
（2）营养物质要协调，注意各营养物质的浓度和比例
（3）PH要适宜，各种微生物适宜生长的PH值范围不同。
二、无菌技术：消毒和灭菌
1、消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。
消毒方法：常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。
2、灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。
3、灭菌方法：
①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；
②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ；
③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。
④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。
比较项
理化因素的作用强度
消灭微生物的数量
芽孢和孢子能否被消灭
消毒
较为温和
部分生活状态的微生物
不能
灭菌
强烈
全部微生物
能
三、实验操作
（一）、制作牛肉膏蛋白胨固体培养基方法步骤：
计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
5、倒平板操作的讨论
①培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
答：可用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
②为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
③平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
④在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
（二）、纯化大肠杆菌
1、微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。
2、用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。
3、平板划线操作的讨论：
①为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
②在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
③在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
4、涂布平板操作的讨论
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。
（三）、恒温箱培养：不同的微生物培养温度不同，一般是37°C恒温箱中，培养12~14小时。
（四）、菌种的保存
（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
①临时保藏方法
将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。
②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。
（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。
13、疑难解答
（1）微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。
（2）确定培养基制作是否合格的方法：将未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
尿素：是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶，尿素最初是从人的尿液中发现的。
一、研究思路
1、筛选菌株
思路：寻找目的菌株时要根据它对生存环境的要求到乡音个的环境中去寻找，
（1）实验室中微生物的筛选应用的原理
人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
（2）选择性培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
（3）配制选择培养基的依据
根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。
2、统计菌落数目
（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。
（2）采用稀释涂布平板法计数的注意事项：①一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC ③本法仅限于形成菌落的微生物。
（3）设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。
3、实验设计
（1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。
（2）制备培养基：制备一尿素为唯一氮源的选择培养基
（3）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。
·测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105 、106
·测定放线菌的数量，一般选用103、104 、105
· 测定真菌的数量，一般选用102、、103、 104
（4）取样涂布
（5）微生物的培养与观察
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
（6）细菌的计数
【旁栏思考题】
如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？
统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值。
每克样品中的菌落数=（C/V）×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数
课题三 分解纤维素的微生物的分离
1、纤维素与纤维素酶
（1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
（2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。
2、纤维素分解菌的筛选
（1）筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。
（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理
刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
3、分离分解纤维素的微生物的实验流程
土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落
（1）土壤采集：选择富含纤维素的环境。
（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤：倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板
（3）刚果红染色法种类
一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；另一种是在倒平板时就加入刚果红。
4、课题延伸
对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后，只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。
旁栏思考题
（1）为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
（2）将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？
将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。
（3）两种刚果红染色法的比较
方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。
方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。
（4）为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
专题三 植物的组织培养技术
课题一 菊花的组织培养
1、植物组织培养
（1）的基本过程
脱分化 再分化 生长
外植体————→愈伤组织————→丛芽（胚状体） （试管苗）
（2）理论基础：植物细胞的全能性
★愈伤组织的细胞：排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。
2、植物组织培养技术的应用有：实现优良品种的快速繁殖；培育脱毒作物；制作人工种子；培育作物新品种以及细胞产物的工厂化生产等。
3、影响植物组织培养的条件
①材料：不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。植物材料的选择直接关系到试验的成败。植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。
②营养：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的培养基是MS培养基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。
③激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。
使用顺序
实验结果
先生长素，
后细胞分裂素
有利于分裂但不分化
先细胞分裂素，
后生长素
细胞既分裂也分化
同时使用
分化频率提高
生长素／ 细胞分裂素比值与结果
比值高时
促根分化，
抑芽形成
比值低时
促芽分化，
抑根形成
比值适中
促进愈伤组织生长

④环境条件：PH、温度、光等环境条件。
不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将pH控制在5.8左右，温度控制在18~22℃，并且每日用日光灯照射12h.
4、操作流程：
配制MS固体培养基—→外植体的消毒 —→接种—→培养—→移栽—→栽培
专题二 月季的花药培养
一、 被子植物的花粉发育：
花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期（单核居中期→单核靠边期）和双核期等阶段。
二、产生花粉植株的两种途径（即通过花药培养产生花粉植株单倍体植株）：
①一种是花粉通过脱分化形成胚状体，然后分化发育为植物；
②另一种是花粉在诱导培养基上脱分化先形成愈伤组织，再将其再分化成植株。
注意：这两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。
注意：①无论哪种产生方式，都要先诱导生芽，再诱导生根
②胚状体：植物体细胞组织培养过程中，诱导产生的形态与受精卵发育成的胚非常类似的结构，其发育也与受精卵发育成的胚类似，有胚芽、胚根、胚轴等完整结构，就像一粒种子，又称为细胞胚。
三、影响花药培养的因素，诱导花粉能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中
1、材料的选择与是主要的影响因素
·亲本的生理状况：花粉早期是的花药比后期的更容易产生花粉植株，选择月季的初花期。
·合适的花粉发育时期：一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高
·花蕾：选择完全未开放的花蕾
2、培养基的组成
亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响
3、实验操作：
①材料的选取：选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。确定花粉发育时期的最常用的方法是醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
②材料的消毒
③接种和培养：·
④鉴定和筛选。
4、植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。两者的不同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。
专题4 酶的研究与应用
课题3 酵母细胞的固定化
课题背景
1、问题：酶对环境条件敏感，易失活；溶液中的酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本；反应后的酶会混合在产物中，如不除去，会影响产品质量。
设想：将酶固定在不溶于水的载体上。
优点：使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以反复利用。
2、问题：一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能得到的。
设想：将合成酶的细胞直接固定。
优点：成本更低，操作更容易。
一、基础知识
（一）固定化酶的应用实例
1、高果糖浆是指果糖含量为42%左右的糖浆，能将葡萄糖转化为果糖的酶是葡萄糖异构酶。
2、使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。
（二）固定化细胞技术
1、固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。
2、一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞体积比酶分子的体积大；体积大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。
3、包埋法法固定化细胞，即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的不溶于水的载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
二、实验操作
（一）制备固定化酵母细胞
1．酵母细胞的活化
活化就是处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。
2．配制物质的量的浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液
3．配制海藻酸钠溶液
加热溶化海藻酸钠时要注意小火间断加热，重复几次，并不断搅拌，直到海藻酸钠融化为止。如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。
4．海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合
将海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的海藻酸钠溶液，进行充分搅拌，使其混合均匀，在转移至注射器中。
5．固定化酵母细胞
以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到刚配制好的CaCl2溶液中，并浸泡30min（时间）左右。
（二）用固定化酵母细胞发酵
1．将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗2-3次。
2．将10%葡萄糖溶液转移至锥形瓶中，加入固定好的酵母细胞，置于25℃下发酵
24h（时间）。
三、结果分析与评价
（一）观察凝胶珠的颜色和形状
如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠浓度浓度偏低，该种凝胶珠包埋的酵母细胞数目少，影响实验效果；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠浓度浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。
（二）观察发酵的葡萄糖溶液
利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。
四、课题延伸
工业生产中，细胞的固定化技术是在严格无菌的条件下进行的。
【教材答案】
练习
1.答：直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点如下表所示。
类型
优点
不足
直接使用酶
催化效率高，低耗能、低污染等。
对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。
固定化酶
酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。
一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的。
固定化细胞
成本低，操作更容易。
固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降等。
3.提示：可以从酶的结构的多样性，对理化条件的敏感程度等角度思考。
专题5 DNA 和蛋白质技术
课题1 DNA的粗提取与鉴定
一、基础知识
（一）提取DNA的方法
提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
（1）DNA的溶解性：
l DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。
l 此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。
（2）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：
蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
（二）DNA的鉴定
在沸水裕条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
二、实验设计
（一）实验材料的选取
凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液
动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用
玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
（三）去除滤液中的杂质
方案一 利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。
方案二 直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10～15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。
方案三 将滤液放在60～75℃的恒温水浴箱保温10～15min，注意严格控制温度范围。
（四）DNA的析出与鉴定
1、将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。
2、取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。
实例：用鸡血细胞液粗提取DNA并鉴定（苏教版必修2）
步骤
操作
图示
1、提取鸡血细胞的细胞核物质
将制备好的鸡血细胞液（已在课前配好）5~10mL，注入到50ml烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5min，然后，用放有纱布的漏斗将血细胞过滤至1000mL的烧杯中，取其滤液。

2、溶解细胞核内的DNA
将物质的量浓度为2mol／L的NaCl溶液40 mL加入到滤液中，并作玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。

3、析出含DNA的粘稠物

沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。

4、滤取含DNA的粘稠物
用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至1000 mL的烧杯中。取纱布上的黏稠物。

5、将DNA的粘稠物再溶解
取一个50 mL烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为2mol／L的NaCl溶液20 mL。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至NaCl溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。

6、过滤含DNA的氯化钠溶液
取一个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶液。取其滤液（DNA溶于滤液中）。

7、提取含杂质较少的DNA

在上述滤过的溶液中，加入冷却的、体积分数为95％的酒精溶液50 mL（加入时动作要慢），并作用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌，至不再增加时，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。

8、DNA的鉴定

取两支20 mL的试管，各加入物质的量浓度为0.015mol／L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。

三、操作提示
1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。
2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
四、课题成果评价
1、是否提取出了DNA
观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。
2、分析DNA中的杂质
本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖、RNA等杂质。
3、不同实验方法的比较
对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的多少、颜色，二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
五、课题延伸
本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的DAN时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）或吐温等化学试剂。
【教材答案】
（一）旁栏思考题
1．为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。
2．加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
3．如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
4．此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？
答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。
5．为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
6．方案二与方案三的原理有什么不同？
答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。

专题六　植物有效成分的提取
课题一　植物芳香油的提取
一、 天然香料的来源：植物或者动物
1、 植物：50多个科的植物
2、 动物：主要来源，灵猫、麝、海狸和抹香鲸等、
二、植物芳香油
1、来源：植物的果实、花、茎、叶、树干、树皮、种子等。
2、芳香油的性质：具有很强的挥发性，易溶于有机溶剂，成分复杂、比重较轻。
3、化学本质：主要包括萜类化合物及其衍生物。
三、提取方法：蒸馏、压榨、萃取等。
1、水蒸气蒸馏法：
原理：水蒸汽可将挥发性较强的芳香油携带出来形成油水混合物，冷却后水油分层。
方法：水中蒸馏：原料放在沸水中加热蒸馏。
水上蒸馏：原料隔放在沸水上加热蒸馏。
水汽蒸馏：利用外来高温水蒸气加热蒸馏。
不足：有些原料不适宜于水中蒸馏，如柑橘、柠檬等易焦糊，有效成分容易水解。通常用压榨法（通过机械压缩力将液相物从液固两相混合物中分离出来的一种简单操作）
2、压榨法：原料易焦糊或者有效成分易溶于水，通常用此方法。
3、萃取法：
原理：芳香油易溶于有机溶剂，溶剂挥发后得到芳香油。如石油醚、酒精、乙醚等。
方法：原料浸泡在溶剂中→得到浸泡液→有机溶剂挥发→芳香油。
不足：有机溶剂中的杂质影响芳香油的品质
四、实验设计：
（一）玫瑰精油的提取：蒸馏法
①采集玫瑰花：采集盛花期（5月中上旬）的玫瑰花，清水清洗沥干。
②装入蒸馏原料：称取50g玫瑰花放入蒸馏瓶，添加200mL蒸馏水。

③安装蒸馏装置：按照从左向右、自下到上次序安装水 蒸气蒸馏装置。
④加热蒸馏：控制蒸馏时间和速度（1～2滴/秒），获得乳白色乳浊液；拆卸装置。
⑤分离油层：向乳浊液加入NaCl溶液后，利用分液漏斗分离 出上面的油层。
⑥除去水分：向油层中加入无水硫酸钠，24h后过滤，得到玫瑰油。
＊注意事项：蒸馏时间不能过短，温度不能过高。
（二）橘皮精油的提取：压榨法
·橘皮精油的主要成分：柠檬烯，主要分布在橘皮中。
·石灰水：防止压榨时滑脱，提高出油率，降低压榨液黏稠度，过滤不堵塞筛眼。
·小苏打、硫酸钠：促进油和水的分离（用量分别为橘皮质量的0.25％和5％）。
·实验步骤：
①橘皮的处理：将新鲜橘皮用清水清洗沥干。
②石灰水浸泡：用7～8％石灰水浸泡橘皮10h以上（如为24h）。
③清水漂洗：浸泡好的橘皮用流水彻底漂洗干净，沥干。
④粉碎和压榨：将橘皮粉碎，加入小苏打和硫酸钠后，用压榨机压榨得到压榨液。
⑤过滤压榨