生物化学》11.第十一章-DNA的生物合成-(复制).ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,(DNA Biosynthesis,，,Replication),第十一章,DNA,的生物合成,(,复制,),复制,是指以亲代,DNA,为模板合成子链,DNA,的过程。,A,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,T,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,C,C,A,C,T,G,G,G,G,T,G,A,C,C,A,G,G,T,A,C,T,G,T,C,C,A,T,G,A,C,T,C,C,A,T,G,A,C,A,G,G,T,A,C,T,G,A,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,T,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,A,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,T,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,+,亲代,DNA,复制叉,子代,DNA,(Basic Rules and System of DNA Replication),第一节,复制基本规律与体系,复制的方式,半保留复制,固定起始点,双向复制,半不连续复制,复制的高保真性,基本规律,一、复制的基本规律,(,一,),半保留复制,1.,概念,DNA,合成时，以亲代,DNA,解开的两股单链为模板，按碱基配对规律，合成子代,DNA,的过程。子代,DNA,，一股单链来源于亲代，另一股单链为新合成。子代和亲代的,DNA,碱基序列一致。这种复制方式称为,半保留复制,。,(1),密度梯度实验,实验结果支持,半保留复制,的设想。,含重氮,-DNA,的细菌,培养于普通培养液,第一代,继续培养于普通培养液,第二代,梯度离心结果,2.,半保留复制的实验依据和意义,(2),子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式,(,混合式,),半保留式,按半保留复制方式，子代,DNA,与亲代,DNA,的,碱基序列一致,，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的,保守性,。,是物种稳定性的分子基础，但,不是绝对的,。,(3),半保留复制的意义,1.,原核生物复制时，,DNA,从,起始点,向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为,双向复制,。,(,三,),双向复制,复制中的放射自显影示意图,环状双链,DNA,及,复制起始点,B.,复制中的两个复制叉,C.,复制接近终止点,ori,ter,A B C,(,二,),固定起始点,复制是从具有特异碱基序列的复制起始点开始。原核生物,(,一个起始点,),，真核生物,(,多个起始点,),。,2.,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个,复制子,。复制子是独立完成复制的功能单位。,5,3,ori,ori,ori,ori,5,3,5,5,3,3,5,5,3,复制子,3,(,四,),复制的半不连续性,3,5,3,5,解链方向,3,5,3,3,5,领头链,(leading strand),随从链,(lagging strand),顺解链方向生成的子链，复制为连续进行，称为,领头链,。,另一股链复制方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，称为,随从链,。,复制中不连续片段称为,岡崎片段,(,okazaki,fragment),。,领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的,半不连续性,。,1.DNA-pol,的核酸外切酶活性和及时校读,A,：,DNA-,pol,的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。,B,：碱基配对正确，,DNA-,pol,不表现活性。,DNA-,pol,外切活性,聚合活性,A,G,A:,C,G,B:,5,/,3,/,5,/,3,/,无活性,(,五,),复制的高保真性,2.,复制保真性的碱基选择,a)DNA,聚合酶靠其大分子结构协调非共价,(,氢键,),与共价键,(,磷酸二酯键,),的有序形成。,b),嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于,反式构型,。,3.DNA,复制保真性依赖三种机制,a),遵守严格的碱基配对规律。,b),聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能。,c),复制出错时,DNA-,pol,的及时校读功能。,N,N,9,P-R,N,H,H,N,N,6,顺式,N,N,9,R-P,N,H,H,N,N,6,反式,二、,DNA,复制的体系,(,一,),底物,(,substrate,),d,ATP,dGTP,dCTP,dTTP,。,(,二,),模板,(template),解开成单链的,DNA,母链。,(,三,),引物,(primer),提供,3,-OH,末端使,dNTP,可以依次聚合的,RNA(DNA),片断。,(,四,),酶和蛋白因子,1.DNA,聚合酶,全称为,依赖,DNA,的,DNA,聚合酶,(DNA-dependent DNA polymerase),，,简称,DNA-,pol,。,(1),活性：,5,3,的聚合活性,；,3,5,外切酶活性,能辨认错配的碱基对，并将其水解；,5,3,外切酶活性,能切除突变的,DNA,片段。,5,A G C T T C A G G A T,A,3,|,3,T C G A A G T C C T A G C G A C 5,?,大肠杆菌,E.coli,中的三种,DNA,聚合酶,分类,DNA,聚合酶,I,DNA,聚合酶,II,DNA,聚合酶,III,分子量,(KD),109,120,900,聚合速率,(,核苷酸,/,分,),1 000,60 000,5,3,聚合酶活性,+,+,+,3,5,外切酶活性,+,+,+,5,3,外切酶活性,+,生物学功能,切除引物,延长冈崎片段,DNA,损伤修复,延长子链,校读作用,校读作用,DNA,损伤修复,(2),原核生物的,DNA,聚合酶,DNA-,pol,DNA-,pol,DNA-,pol,DNA-pol(109kD),小片段,5,核酸外切酶活性,大片段,/,Klenow,片段,DNA,聚合酶活性 ，,5,核酸外切酶活性,N,端,C,端,木瓜蛋白酶,DNA-,pol,Klenow,片段是实验室合成,DNA,的常用工具酶。,功能,:,对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-,pol,(120kD),DNA-,pol,II,基因发生突变，细菌依然能存活。它参与,DNA,损伤的应急状态修复。,功能：,是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-,pol,(250kD),(3),真核生物的,DNA,聚合酶,填补引物,空隙，切,除修复，,重组,延长子,链的主,要酶，,解螺旋,酶活性,线粒体,DNA,复,制,起始引,发，引,物酶活,性,功能,+,+,+,-,-,3,5,高,高,高,？,中,5,3,聚合活性,25.5,12.5,14.0,4.0,16.5,分子量（,kD,）,DNA,-,pol,填补引物,空隙，切,除修复，,重组,延长子,链的主,要酶，,解螺旋,酶活性,线粒体,DNA,复,制,起始引,发，引,物酶活,性,+,+,+,-,-,3,5,外切,酶活性,高,高,高,？,中,5,3,聚合活性,25.5,12.5,14.0,4.0,16.5,分子量（,kD,）,DNA,-,pol,参与损伤与修复,生物学,(1),解螺旋酶,(,helicase,),利用,ATP,供能，打开氢键，使,DNA,双链解开成为两条单链。,(2),引物酶,(,primase,),复制起始时催化生成,RNA,引物的酶。,(3),单链,DNA,结合蛋白,(single stranded DNA binding protein,SSB),在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,2.,其他酶与蛋白因子,稳定已解开的单链,单链,DNA,结合蛋白,SSB,催化,RNA,引物生成,引物酶,DnaG,(,dnaG,),运送和协同,DnaB,DnaC,(,dnaC,),解开,DNA,双链,解螺旋酶,DnaB,(,dnaB,),辨认起始点,DnaA,(,dnaA,),蛋白因子,通用名,功能,10,8,局部解链后,拓扑异构酶,切断,DNA,双链中,一股,链，使,DNA,解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，,DNA,变为松弛状态,。,反应,不需,ATP,。,拓扑异构酶,切断,DNA,分子,两股,链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用,ATP,供能连接断端，,DNA,分子进入负超螺旋状态。,(4)DNA,拓扑异构酶,(DNA,topoisomerase,),指理顺,DNA,链，改变超螺旋状态的酶，分为,I,型和,II,型。,(5)DNA,连接酶,(DNA,ligase,),连接,DNA,链,3,-OH,末端和相邻,DNA,链,5,-P,末端，使二者生成,磷酸二酯键,，从而把两段相邻的,DNA,链连接成一条完整的链。,3,HO,5,3,3,5,DNA,连接酶,ATP,ADP,5,3,5,第二节,DNA,复制的过程,(The Process of DNA Replication),(,一,),复制的起始,需要解决两个问题,DNA,解开成单链，提供模板。,合成引物，提供,3,-,OH,末端。,一、原核生物的,DNA,生物合成,E.coli,复制起始点,oriC,GATTNTTTATTT,GATCTNTTNTATT,GATCTCTTATTAG,1 13 17 29 32 44,TGTGGATTA-,-ACACATATT-,-,TTTGGATAA-,-,ACACCTATT,58 66 166 174 201 209 237 245,串联重复序列,反向重复序列,5,3,5,3,1,.,DNA,解链的,起始点,Dna,A,Dna,B,、,Dna,C,DNA,拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2,.,引发体和引物,含有解螺旋酶、,DnaC,蛋白、引物酶和,DNA,复制起始区域的复合结构称为,引发体,。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链,RNA,分子。,引物,3,HO,5,引物酶,5,3,5,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH 3,3,DNA-,pol,复制的延长指在,DNA-,pol,催化下，,dNTP,以,dNMP,的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,(,二,),复制的延长,领头链的合成,1.,领头链的延长,领头链沿着,5,/,3,/,方向可以连续的延长。,2.,随从链的延长,复制简图,复 制 延 长 动 画,1.,原核生物基因是环状,DNA,，双向复制的复制片段在复制的终止点,(,ter,),处汇合,。,ori,ter,E.coli,82,32,ori,ter,SV40,50,0,(,三,),复制的终止,5,5,5,RNA,酶,OH,P,5,DNA-,pol,dNTP,5,5,P,ATP,ADP+Pi,5,5,DNA,连接酶,2.,随从链上不连续性片段的连接,哺乳动物的细胞周期,DNA,合成期,G,1,G,2,S,M,二、真核生物的,DNA,生物合成,真核生物,DNA,复制在细胞周期的,S,期进行，也可分为起始、延长和终止三个阶段，每个阶段的基本过程与原核生物,DNA,复制相似，但存在不少差异。,1.,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。,2.,复制的起始需要,DNA-,pol,（引物酶活性）和,pol,（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子,(replication factor,RF),。,3.,增殖细胞核抗原,(proliferation cell nuclear antigen,PCNA),在复制起始和延长中起关键作用。,(,一,),复制的起始,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代,DNA,随从链,引物,核小体,(,二,),复制的延长,真核生物的聚合酶,催化子链的延长，并有校正功能。引物和冈崎片段,(,约,200bp),都比较短。,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,1.,染色体,DNA,呈线状，复制在末端停止。,2.,复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。,3.,染色体两端,DNA,子链上复制的,RNA,引物，去除后留下空隙。,(,三,),复制的终止,1.,端粒,(telomere),指真核生物染色体线性,DNA,分子末端的结构。,TTTT,GGGG,TTTT,GGGG,(,四,),端粒与端粒酶,3.,功能,维持染色体的稳定性。,维持,DNA,复制的完整性。,2.,结构特点,由末端单链,DNA,序列和蛋白质构成。,末端序列是多重复富含,G,、,C,的短序列。,4.,端粒酶,(telomerase),端粒酶,RNA,(human telomerase RNA,hTR,),端粒酶协同蛋白,(human telomerase,associatedprotein,1,hTP1),端粒酶逆转录酶,(human telomerase reverse transcriptase,hTRT,),5.,端粒酶催化作用的爬行模型,真核,DNA,复制后，两个,5,末端的引物被切除，缺口无法填补，故,DNA,将面临多次复制而逐渐缩短的问题。,第三节,DNA,损伤与修复,突变,(Mutation),是指,DNA,分子中碱基序列的改变，又称为,DNA,损伤,(DNA damage),。,意义,突变是进化、分化的分子基础,突变导致基因型改变,突变导致死亡,突变是某些疾病的发病基础,(DNA Damage and Repair),一、引发突变的因素,1.,物理因素,紫外线,(ultra violet,UV),、各种辐射,(,一,),自发因素,(,二,),诱发因素,复制过程中发生的突变，,可发生,10,-16,频率的突变。,P,R,R,N,N,H,O,O,CH,3,N,N,H,O,O,CH,3,P,R,R,N,N,H,O,O,CH,3,N,N,H,O,O,CH,3,UV,嘧啶二聚体,2.,化学因素,常见的化学诱变剂,化合物类别,作,用,点,分子改变,碱基类似物,如：,5,-,FU,A,5,-,FU,G,-,A,-,-,T,-,-,G,-,-,C,-,羟胺类（,NH,2,OH,）,T,C,-,T,-,-,A,-,-,C,-,-,G,-,亚硝酸盐（,NO,2,）,C,U,-,G,-,-,C,-,-,A,-,-,T,-,烷化剂,如：氮芥类,G,m,G,G,m,G,DNA,缺失,G,3.,生物因素,如逆转录病毒等。,(,三,),突变的类型,错配,缺失,插入,重排,框移,DNA,分子上的碱基错配称,点突变,(point mutation),。,(1),转换,:,发生在同型碱基之间，即嘌呤代替,另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。,(2),颠换,:,发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧,啶或嘧啶变嘌呤。,1.,错配,(mismatch),2.,重排,(rearrangement),DNA,分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,3.,缺失,(deletion),、插入,(insertion),和框移,(frame-shift),(1),缺失：一个碱基或一段核苷酸链从,DNA,大分子上消失。,(2),插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到,DNA,大分子中间。,(3),缺失或插入都可导致,框移突变,。,谷 酪 蛋 丝,5 ,G,C,A,G U A,C A U,G U C,丙 缬 组 缬,正常,5 ,G A G,U A C,A U G,U C,缺失,C,框移突变,是,指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,二、,DNA,损伤的修复,修复,(repairing,),：,是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复原有的天然状态。,光修复,(light repairing),切除修复,(excision repairing),重组修复,(recombination repairing),SOS,修复,类型,P,R,R,N,N,H,O,O,CH,3,N,N,H,O,O,CH,3,P,R,R,N,N,H,O,O,CH,3,N,N,H,O,O,CH,3,(,一,),光修复,光修复酶,(,photolyase,),UV,(,二,),切除修复,是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由,DNA-,pol,和连接酶完成。,UvrA,UvrB,UvrC,OH,P,DNA,聚合酶,OH,P,DNA,连接酶,ATP,E.coli,的切除修复机制,切 除 修 复 动 画,(,三,),重组修复,(,四,)SOS,修复,1.,当,DNA,损伤难以复制时，而诱发出一系列复杂的反应。,2.,在,E.coli,，各种与修复有关的基因，组成一个称为,调节子,(,regulon,),的网络式调控系统。,3.,这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过,SOS,修复，复制如能继续，细胞可存活。但,DNA,保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,