In-Fusion克隆技术介绍.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,In-Fusion,克隆技术介绍,宝日医生物技术（北京）有限公司,5/22/2025,基因克隆背景简介,TA,克隆,限制性酶切克隆,平滑末端克隆,缺点：连接效率低,耗时较长,需要特定限制性酶切位点,5/22/2025,2,In-Fusion,克隆产品,Clontech,专利,In-Fusion,HD Cloning System,任意载体,任意基因片段,这是一款让您,随心所欲,地实现基因定向克隆的产品！,5/22/2025,3,In-Fusion,基因克隆特点,4,主要内容,2,In-Fusion,优点及应用实例,3,In-Fusion,系列产品介绍,4,常见问答,1,In-Fusion,克隆技术的原理,5/22/2025,5,5/22/2025,6,主要内容,2,In-Fusion,优点及应用实例,3,In-Fusion,系列产品介绍,4,常见问答,1,In-Fusion,克隆技术的原理,In-Fusion,基因克隆技术原理示意图,In-Fusion,专利酶,Clontech,专利,In-Fusion,是一种,快速、简单、高效,的基因克隆技术！,50,，15 min,单管反应,7,5/22/2025,8,主要内容,2,In-Fusion,优点及应用实例,3,In-Fusion,系列产品介绍,4,常见问答,1,In-Fusion,克隆技术的原理,In-Fusion,克隆技术的优点,不附加任何多余序列,2,不受限制性内切酶酶切位点的限制,3,可同时克隆两个或多个,DNA,片段,4,1,简便、快速、高效的克隆技术,5/22/2025,9,简便、快速、高效的克隆技术,快速！,5/22/2025,10,In-Fusion HD,无论是克隆,长基因片段,还是克隆,多个基因片段,都能保持较高的克隆效率。,高效！,简便、快速、高效的克隆技术,5/22/2025,11,不附加任何多余序列,线性化载体,任意载体,克隆位点,目的,DNA,片段,不需要的碱基序列,引物设计,PCR,扩增,与载体相同的,15,个碱基 序列,In-Fusion,连接反应,15 min,不附加任何多余序列,的重组载体,无缝克隆：,不附加任何多余序列,A,B,C,5/22/2025,12,不受限制性内切酶酶切位点的限制,In-Fusion,克隆不受限制性内切酶酶切位点的限制,:,在,cDNA,序列中插入,内含子,荧光蛋白基因,在,cDNA,序列添加,UTRs,转换纯化标签例如,Myc,转换为,His,缺失,蛋白表达区域,表达载体,选择插入位点,PCR,扩增,纯化,目的,DNA,片段,混合,In-Fusion,In-Fusion,引物设计,PCR,扩增,重组载体,5/22/2025,13,可同时克隆两个或多个,DNA,片段,Step 2:,目的,DNA,片段扩增,Step 3:,一次,In-Fusion,连接反应,Step 1:,制备线性化载体,片段,1,片段,2,片段,3,线性化载体,重组载体,5/22/2025,14,克服传统克隆技术的限制,克服其它克隆技术的限制,其它克隆技术的限制,In-Fusion,解决方案,载体的限制,不同克隆试剂盒都需要与之匹配的载体,必须使用提供的载体,只要载体末端和插入片段末端具有,15,个同源碱基，,In-Fusion,就可以将,任意,PCR,片段插入任意线性化载体中。,必须进行限制性内切酶酶切和连接,需要独一无二、兼容的酶切位点,极少的合适酶切位点,In-Fusion,不受限制性酶切位点的限制,，因此在目的片段及使用的载体中是否存在合适的酶切位点并不妨碍克隆。,亚克隆繁琐,多片段不能同时克隆,In-Fusion,能够在,一次反应中同时克隆多个片段，无需进行亚克隆。,对于大片段克隆效率较低,对于插入片段有限制,In-Fusion,系统能够,高效克隆,0.05-15 kb,DNA,片段。,非定向克隆需要筛选目的片段插入方向,正确的克隆,In-Fusion,是,基因定向克隆技术,，因此无需进行目的基因片段正确插入的克隆的筛选。,会附加多余碱基序列,In-Fusion,是,无缝克隆：不附加任何多余碱基序列。,不适合中型和大规模克隆工程,In-Fusion,技术已经,成功用于多项高通量克隆工程。,5/22/2025,15,In-Fusion,克隆技术的应用,多片段克隆,构建载体模型,插入突变位点,高通量克隆,5/22/2025,16,应用实例,实例：多个,DNA,片段（,1 kb,2 kb,3 kb),同时克隆,【,方法,】,使用,TaKaRa,高品质,PCR,酶分别扩增,1 kb,、,2 kb,、,3 kb,的目的,DNA,片段,和,2.7 kb,的载体，并将扩增产物混合，使用,In-Fusion,HD,试剂盒完成,克隆。利用高效率的感受态细胞,Stellar,TM,Competent Cells,（产品编,号：,636763,）转化并进行蓝,/,白斑筛选。,5/22/2025,17,引物设计及目的基因片段扩增,引物的,5,末端必须包含与,载体末端相同,的,15,个碱基序列,引物的,3,末端必须包含与,目的基因片段相互补,的特异碱基序列,5/22/2025,18,载体线性化,PCR,扩增,酶切处理,5/22/2025,19,In-Fusion,连接反应,In-Fusion,专利酶,线性化载体,目的基因片段,反应液,直接转化,In-Fusion,连接反应,50 15 min,【,结果,】,Cloning Enhancer,处理，,37 15 min,，,80 15 min,5/22/2025,20,引物设计原则,引物的,5,末端必须包含与,载体末端相同,的,15,个碱基序列,引物的,3,末端必须包含与,目的基因片段相互补,的特异碱基序列,5/22/2025,21,引物设计原则,5/22/2025,22,引物设计网络工具,In-Fusion HD Enzyme Premix,pUC19 Control Vector,linearized(50 ng/l),2 kb Control Insert(40 ng/,l),In-Fusion,HD Cloning Kit,（,639648/49/50),组分,5/22/2025,26,附带,Cloning Enhancer,的相关产品,Cloning Enhancer,的作用,：,消除,PCR,反应液中的引物二聚体和,dNTP,等的影响,无需对,PCR,产物进行胶纯化,操作简单,In-Fusion,HD Cloning Kit w/Cloning Enhancer(639633/34/35),5/22/2025,27,Up to 5X Higher Efficiency,未经处理,Cloning Enhancer,处理,Cloning Enhancer,的实用例,5/22/2025,28,5/22/2025,29,主要内容,2,In-Fusion,优点及应用实例,3,In-Fusion,系列产品介绍,4,常见问答,1,In-Fusion,克隆技术的原理,In-Fusion Kit,常见问答,Q1.,如何选择,PCR,酶？,A1.,可以,使用任何,PCR,酶。由于科研人员进行克隆表达的实验较多，我们推荐使用高保真的,PCR,酶。,Q2.,载体和插入的,DNA,片段末端结构有限制吗？,A2.,没有特别的限制。无论是平滑末端、粘性末端或者末端有无,A,尾均可,进行有效的连接反应。,Q3.,载体和插入的,DNA,片段的长度有限制吗？,A3.,没有特别的限制。载体和插入的,DNA,片段即使超过,10 kb,也可以进,行连接反应，只是连接效率会有所降低。插入的,DNA,片段只要不少,于,50 bp,就可进行有效的连接反应。,Q4.,线性化载体末端是否需要进行去磷酸化处理？,A4.,线性化载体末端磷酸基团的存在与否不会影响,In-Fusion,连接效率。,因此，不需要对线性化载体进行去磷酸化处理。,5/22/2025,30,技术支持,：,800-810-6261,；,010-80720985,/,86,：,service,：,我们将竭诚为您服务！,5/22/2025,31,Thank You,！,5/22/2025,32,3Q,！,