Sanger双脱氧链终止法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA,测序的基本方法,Sanger,双脱氧链终止法,1,基本原理：,核苷酸的连接方式：磷酸二酯键,将,2,，,3,双脱氧核苷酸（,ddNTP,）,参入到新合成的,DNA,链中，由于参入的,ddNTP,缺乏,3,羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，,DNA,合成反应将中止。,2,通常,DNA,的复制需要：,DNA,聚合酶，纯单链,DNA,模板，带有,3-OH,末端的单链寡核苷酸引物，,4,种,dNTP,（,dATP,、,dGTP,、,dTTP,和,dCTP,），,ddNTP,。,3,4,单链,DNA,可以由双链,DNA,完全变性而得到。,其方法，简单的来说，,将反应体系加热至,95,即可得到。,所需模板及其获得方法：,5,dATP,为三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸，生物用,dNTP,来合成,DNA,。,ddATP,为三磷酸腺嘌呤双脱氧核苷酸，核糖,2,号,3,号,C,上羟基的,O,被脱去，由于它掺入,DNA,后,DNA,的合成就终止了，所以,ddNTP,是用来测序的。,dATP,与,ddATP,的区别,：,6,DNA,聚合酶的特点：,其耐热性极强,在,95 40 min,仍具有,很强的聚合活性,;,利用重组酶在常规,PCR,条件下,成功扩增了,5.3 kb,的拟南芥,Timeless,基因片段,.,7,可以购买通用引物或实验室合成,15bp,26bp,长度的引物，通常以,2g/ml,的浓度贮存于,-20,备用。,关于引物：,8,Sanger,双脱氧链终止法的具体操作：,测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外分,别加入,2,3-,双脱氧的,A,C,G,T,核苷三磷酸,(,称为,ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP),然后进行,聚合反应,.,在第一个反应物中,ddATP,会随机地代,替,dATP,参加反应一旦,ddATP,加入了新合成的,DNA,链,由于其,3,位的羟基变成了氢,所以不能继续延伸,.,所以第一个反应中所产生的,DNA,链都是到,A,就终止,了,;,同理第二个反应产生的都是以,C,结尾的,;,第三个反,应的都以,G,结尾,第四个反应的都以,T,结尾,电泳后就,可以读出序列了,.,9,假如有一个,DNA,互补序列是,GATCCGAT,我们试着做一下,:,在第一个反应中由于含有,dNTP+ddATP,所以遇到,G,T,C,三个碱基时没什么问题,但遇到,A,时,掺入的可能是,dATP,或,ddATP,比如已合成到,G,下一个如果参与反应的是,ddATP,则终止,产生一个仅有,2,个核苷酸的序列,:GA,否则继续延伸,可以产生序列,GATCCG,又到了下一个,A,了,.,同样有两种情况,如果是,ddATP,掺入,则产生的序列是,GATCCGA,延伸终止,否则可以继续延伸,产生,GATCCGAT.,将得到如下结果：,1,产生的都是以,A,结尾的片段,:GA,GATCCGA,。,2,3,4,产生的都是以,C,结尾的片段,:GATC,GATCC,产生的都是以,G,结尾的片段,:G,GATCCG,产生的都是以,T,结尾的片段,:GAT,GATCCGAT,10,制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得,DNA,的碱基序列。,即可得到测序结果：为,GATCCGAT,11,Many Thanks,12,