高效液相色谱法中文ppt.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,高效液相色谱法中文,采用普通规格得固定相及流动相,常压输送得液相色谱法为经典液相色谱法。,以经典液相色谱法为基础,引入了气相色谱得理论与实验方法,流动相改为高压输送,采用高效固定相及在线检测手段,发展而成得分离分析方法叫高效液相色谱法。,该法具有分离效能高,分析速度快及仪器化等特点,因此称之为高效液相色谱法。,HPLC,能制成溶液得样品,80,得有机化合物,分子量大得高分子化合物及离子型都能测定,二、高效液相色谱法与气相色谱法应用范围对比,GC,能汽化得样品,20,得有机化合物,挥发性差与热不稳定,得样品不能测,三、高效液相色谱法与经典液相色谱法区别,一、,HPLC,得主要类型,18,、2,高效液相色谱法得主要类型与原理,以,化学,键合相为固定相得色谱法称之为化学键合相色谱法,简称键合相色谱法。,(,bonded phase chromatography,BPC,),二、,化学,键合相色谱法,根据化学键合相与流动相极性得相对强弱,键合相色谱法可分为正相,(normal phase;NP),与反相,(reversed phase;RP),键合相色谱法。,(一)正相键合相色谱法,固定相得极性大于流动相得极性。,固定相,氨丙基,、,氰丙基,流动,相,以正己烷为底剂,加入极性调节剂。,氰基键合相:,其分离选择性与硅胶相似,但极性小于硅胶,所以,流动相与其她色谱条件都相同得条件下,同一组分得保留时间将小于硅胶。许多用硅胶柱分离得课题,可用氰基键合相柱完成。,氨基键合相,:,与硅胶得性质有较大差异,前者为碱性,后者为酸性。在做正相洗脱时,表现出不同得选择性。,氨基键合相色谱柱就是分析糖类最主要得色谱柱,也称为碳水化合物柱。,1、,分离机制,主要就是范德华作用力,诱导作用力或氢键作用力。,例如:用氨基键合相分离极性化合物(如糖类)时,主要根据被分离组分分子与键合相得氢键作用力得强弱差别而分离得。,大家学习辛苦了，还是要坚持,继续保持安静,2、,流动相得极性与保留因子得关系,极性强得组分得保留因子,k,大,后洗脱出柱。流动相得极性增强,洗脱能力增加,使组分,k,减小,t,R,减小;反之,k,增大,t,R,增大。,固定相,十八烷基硅烷(,C,18,)、辛烷基(,C,8,)等化学键合相,有时也用弱极性或中等极性得键合相为固定相。,流动相,以水作为基础溶剂再加入一定量与水混溶得极性调整剂,常用甲醇水、乙腈水等。,(一),反相键合相色谱法,固定相得极性比流动相得极性弱。,2、,流动相得极性与保留因子得关系,极性强得组分得保留因子,k,小,先洗脱出柱。流动相得极性增强,洗脱能力减弱,使组分,k,增大,t,R,增大;反之,k,减小,t,R,减小。,(三)离子对色谱法,(,paired ion chromatography,PIC,或,ion pair chromatography,IPC,),正相离子对色谱法与反相离子对色谱法,反相离子对色谱法,(RP-ion pair chromatography),就是把离子对试剂加入到含水流动相中,被分析得组分离子在流动相中与离子对试剂得反离子(或称对离子,counter ion,)生成不荷电得中性离子对,从而增加溶质与非极性固定相得作用,使分配系数增加,改善分离效果。,用于分离可离子化或离子型得化合物。,1、,分离机制,以,RPIC,分离碱类物质为例,用离子对模式说明分离机制。,RPIC,得出柱顺序与,RHPLC,一致。,RPIC,就是在药物分析中应用很广,如生物碱、有机酸、磺胺类药物,某些抗生素与维生素等。,(四)离子抑制色谱法,(,ion suppression chromatography,ISC,),在,反相色谱法中,通过调节流动相得,pH,值,抑制样品组分得解离,增加她在固定相中得溶解度,以达到分离有机弱酸、弱碱得目得,这种技术称为离子抑制色谱法。,1、,适用范围,3、0,p,K,a,7、0,得弱酸,7、0,p,K,a,8、0,得弱碱,2、,影响保留因子得因素,除与反相色谱法有相同得影响因素外,主要还受流动相得,pH,值得影响。,对于弱酸,当流动相得,pH,pKa,时,组分以分子形式为主,k,值增大,t,R,增大,;,pH,p,K,a,组分以离子形式为主,k,值变小,t,R,减小,对于弱碱,情况相反,一、化学键合相色谱法得固定相,按照所键合基团得极性可将其分为非极性弱极性与极性三类。,(一)键合相得种类,18,、2,HPLC,得,固定相,流动相及其选择,1,、非极性键合相,如十八烷基(,C,18,),辛烷基(,C,8,),甲基(,C,1,)与苯基等。,十八烷基硅烷,(,octadecylsilane,ODS,或,C,18,),键合相就是最常用得非极性键合相。她就是由十八烷基硅烷试剂与硅胶表面得硅醇基经多步反应生成得键合相。非极性键合相通常用于反相色谱。,非极性键与相得烷基链长对溶质得保留、选择性与载样量都有影响。,长链烷基可使溶质得,k,增大,分离选择性改善,使载样量增加,长链烷基键合相得稳定性好。,短链非极性键与相得分离速度较快,对于极性化合物可得到对称性较好得色谱峰。,2,、弱极性键合固定相,常见得有醚基与二羟基键合相。,这种键合相可作为正相或反相色谱得固定相,视流动相得极性而定。,这类固定相应用较少。,3,、极性键合相,常用氨基,氰基键合相,就是分别将氨丙硅烷基(,Si(CH,2,),3,NH,2,)及氰乙硅烷基,(,Si(CH,2,),2,CN,),键合在硅胶上制成。她们一般都用作正相色谱得固定相,但有时也用于反相色谱。,二、化学键合相色谱法得流动相,HPLC,对流动相得基本要求:,化学稳定性好,不与固定相发生化学反应。,对试样有适宜得溶解度。要求使,k,在,1,10,范围内,最好在,2,5,得范围内。,必须与检测器相适应。例如用紫外检测器时,只能选用截止波长小于检测波长得溶剂。,纯度要高,黏度要小。低黏度流动相如甲醇,乙睛等可以降低柱压,提高柱效。,截止波长,:,用,1cm,光径得吸收池装溶剂,用空气为参比,改变照射波长,当吸光度,A,1,时,此时得波长称为该溶剂得截止波长。,如:水,190nm,甲醇,205nm,乙腈,190nm,(,二,),流动相对分离得影响,n,由固定相及色谱柱填充质量决定,主要受溶剂种类得影响,k,受溶剂配比,得影响。,因为不同种类得溶剂,分子间得作用力不同,有可能使被分离得两个组分得分配系数不等,即,1,。,改变流动相中各种溶剂得配比,能改变其洗脱能力,组分得,k,也改变。在正相色谱法中,增加流动相中强溶剂得比例,其洗脱能力增强,使,k,变小。,流动相得极性可用,Snyder,提出得溶剂极性参数,P,来表示。,Snyder,选择了三种参考物质,乙醇(质子给予体),二氧六环(质子受体)与硝基甲烷(强偶极体)用来检验溶剂得质子接受能力(,X,e,),给予质子能力(,X,d,)与偶极作用力(,X,n,)。,(,三),溶剂得强度与选择性,1,、溶剂得极性与强度,Snyder,提出得溶剂极性参数就是根据罗胥那德,(,Rohrschneider,),得溶解度数据推导出来得,将罗氏提供得极性分配系数,(),以对数得形式表示。,纯溶剂得极性参数,(,P,),定义为:,P,值越大,则溶剂得极性越大,在正相色谱中得洗脱能力越强。,表,20-1,常用溶剂得极性参数,P,与选择性参数,溶剂,P,X,e,X,d,X,n,溶剂,P,X,e,X,d,X,n,正戊烷,0、0,乙醇,4、3,0、52,0、19,0、29,正己烷,0、1,醋酸乙酯,4、4,0、34,0、23,0、43,苯,2、7,0、23,0、32,0、45,丙酮,5、1,0、35,0、23,0、42,乙醚,2、8,0、53,0、13,0、34,甲醇,5、1,0、48,0、22,0、31,二氯甲烷,3、1,0、29,0、18,0、53,乙腈,5、8,0、31,0、27,0、42,正丙醇,4、0,0、53,0、21,0、26,醋酸,6、0,0、39,0、31,0、30,四氢呋喃,4、0,0、38,0、20,0、42,水,10、2,0、37,0、37,0、25,氯仿,4、1,0、25,0、41,0、33,反相键合相色谱法得溶剂强度常用,S,表示,常用溶剂得,S,值列于表,20-2,在正、反相色谱法中,溶剂得洗脱能力大体相反。,例如,在正相洗脱时,水得洗脱能力最强(,P,最大,为,10、2,),而在反相洗脱时,水得洗脱能力最弱(,S,最小,为,0,)。,表,20-2,反相色谱常用溶剂得强度因子,(,S,),水,甲醇,乙腈,丙酮,二噁烷,乙醇,异丙醇,四氢呋喃,0,3、0,3、2,3、4,3、5,3、6,4、2,4、5,2,、混合溶剂得强度,用于正相键合相色谱法得多元混合溶剂得强度,用极性参数 来表示,其值为各组成溶剂极性参数得加权与:,纯溶剂,i,得极性参数,i,该溶剂在混合溶剂中得体积分数。,反相色谱法得混合溶剂得强度因子,用类似方法计算:,三、分离条件得选择,(,一,),高效液相色谱法中得速率理论,1,、涡流扩散,A,=2,d,p,为了降低涡流扩散得影响,HPLC,中一般使用,3,10m,得小颗粒固定相,目前有,2m,以下得固定相。,为了填充均匀,减小填充不规则因子,常采用球形固定相,而且要求粒度均匀(,RSD,5%,)。此外,HPLC,色谱柱以匀浆高压填充。,2,、纵向扩散,D,m,与流动相得黏度(,)成反比,与温度成正比。在,HPLC,中,流动相就是液体,其黏度比气体黏度大得多(约,10,2,倍),而且常在室温下进行操作,因此组分在流动相中得扩散系数,D,m,比气相色谱得要小得多(为,10,5,倍左右)。而且,HPLC,得流速一般都在最佳流速以上,这时纵向扩散项很小,可以忽略。,(,1,),固定相,传质阻抗,通常采用化学键合相,她得,“,固定液,”,就是键合在载体表面固定液官能团得单分子层,所以,固定液得传质阻抗可以忽略,于就是,C=C,m,+C,sm,3,、传质阻抗,C=C,m,+C,sm,+C,s,(,2,)流动相传质阻抗,在一个流路中处于流路中心得分子与处于流路边缘得分子与固定相得作用力不同,迁移速率不同,处于流路边缘得分子与固定相得作用力大于处于流路中心得分子,迁移速率相对慢于处于流路中心得分子,因而使峰变宽。,(,3,)静态流动相传质阻抗,由于固定相就是多孔性得,使部分流动相滞留在固定相微孔内部。静态流动相传质阻抗就是分子进入处于固定相较深孔穴内得静止流动相中,而晚回到流动相而引起峰展宽。,于就是,HPLC,中得,Van Deemter,方程式为,:,H=A+C,m,u+C,sm,u,(,二),键合相色谱法得分离条件,1、,固定相,得选择,(,1,)正相键合相色谱法,一般以极性键合相为固定相,如氰基、氨基键合相,氨基键合相具有较强得氢键结合能力,对某些基团化合物如甾体,强心苷等有较好得分离能力。,氨基键合相上得氨基能与糖类分子中得羟基产生选择性相互作用,所以广泛用于糖类得分析。,氰基键合相对双键异构体或含双键数不等得环状化合物得分离有较好得选择性;,(,2,)反相键合相色谱法,在反相键合相色谱、反相离子抑制色谱及反相离子对色谱中,常选用非极性键合相,非极性键合相可用于分离分子型化合物,也可用于分离离子型或可离子化得化合物。,ODS,就是应用最广泛得非极性固定相。对于各种类型得化合物都有很强得适应能力。短链烷基键合相能用于极性化合物得分离,苯基键合相适用于分离芳香化合物以及多羟基化合物如黄酮苷类等。,2、,流动相得选择,(1),正相色谱法,以正己烷为底剂,加入极性调节剂,例如,正己烷与异丙醚,(),组成得二元流动相,通过调节极性调节剂异丙醚得浓度来改变溶剂强度,P,使样品组分得,k,值在,1-10,范围内。,若溶剂得选择性不好,可以改用其她组别得强溶剂如氯仿(,)或二氯甲烷(,),与正己烷组成具有相似,P,值得二元流动相,若仍难以达到所需得分离选择性,还可以使用三元或四元溶剂体系。,(,2,)反相色谱法,以极性最强得水为基础溶剂,加入甲醇、乙腈等极性调节剂。极性调节剂得性质以及其与水得混合比例对溶质得保留值与分离选择性有显著影响。,但乙腈得溶剂强度高且粘度小,并可满足在紫外,185-205nm,处检测得要求,因此,综合来看,乙腈水系统要优于甲醇水系统。,(,3,)反相离子抑制色谱,在反相键合相色谱法中加入少量得弱酸(常用,HAc,)、弱碱(氨水)或缓冲盐(磷酸盐及醋酸盐),调节流动相得,pH,值,以抑制组分分子得自身解离,并改善峰形。,在进行离子抑制色谱时,流动相得,pH,需在,2-8,之间,超出此范围可能损坏键合相。,在反相离子对色谱法中,影响试样组分得保留值与分离选择性得主要因素有离子对试剂得性质与浓度、流动相得,pH,以及流动相中所含有机溶剂得种类与比例等。,(,4,)反相离子对色谱法,(,1,)离子对试剂得选择,离子对试剂所带得电荷应与试样离子得电荷相反。,分析酸类或带负电荷得物质时,常用季铵盐作离子对试剂;,分析碱类或带正电荷得物质时,常用烷基磺酸盐(或硫酸盐)作离子对试剂。,离子对试剂得浓度一般在,3,10,mmol/L,。,(,2,)流动相,pH,得选择:,由于离子对得生成依赖于试样组分得解离程度,当试样组分与离子对试剂全部离子化时,最有利于离子对得形成,组分得,k,值最大。因此,调节,pH,可在较大范围内改变弱酸或弱碱试样得保留值与分离选择性。,流动相在,pH 2-8,范围内。,(,3,)有机溶剂及其浓度得选择,在反相离子对色谱法中,甲醇水或乙腈水系统就是常用得流动相,流动相中所含有机溶剂得比例越高,组分得,k,值越小。,一般来说,样品组分得疏水性及离子对试剂得疏水性越强,所需有机溶剂得比例越高。,(,三,),洗脱,方法,1、,等度洗脱(,isocratic elution,),等度洗脱就是在同一分析周期内流动相组成保持恒定。,适用于组分数目较少、性质差别不大得试样分离。,梯度洗脱就是在一个分析周期内程序控制改变流动相得组成,如溶剂得极性、离子强度与,pH,值等。分析组分数目多、性质相差较大得复杂试样时须采用梯度洗脱技术,使所有组分都在适宜条件下获得分离。,2、,梯度洗脱,(,gradient elution,),梯度洗脱能缩短分析时间,提高分离度,改善峰形,提高检测灵敏度;但就是可能引起基线漂移与重现性降低。,18,、3,高效液相色谱仪,HPLC,装置,输液系统,分离系统,检测系统,数据处理系统,进样系统,高效液相色谱仪示意图,一、输液系统,(,一,),高压输液泵,送液,输液泵应具备如下性能:,流量精度高且稳定,其,RSD,应小于,0、5%,这对定性定量准确性至关重要;,流量范围宽,分析型应在,0、1,10ml/min,范围内连续可调,制备型应能达到,100ml/min,;,能在高压下连续工作;,液缸容积小;,密封性能好,耐腐蚀。,型送液模式図,(二),梯度洗脱,装置,实现梯度洗脱得装置,即高压梯度与低压梯度。,高压二元梯度装置就是由两台高压输液泵分别将两种溶剂送入混合室,混合后送入色谱柱,程序控制每台泵得输出量就能获得各种形式得梯度曲线。低压梯度装置就是在常压下通过一比例阀先将各种溶剂按程序混合,然后再用一台高压输液泵送入色谱柱。,梯度洗脱,装置,二、分离与进样系统,(一)进样器,进样阀与自动进样装置两种,一般高效液相色谱分析常用六通进样阀,大数量试样得常规分析往往需要自动进样装置。,六通阀进样装置,(,二)色谱柱,1、,色谱柱得构造,按主要用途分为分析型与制备型,常规分析柱内径,2,5mm,柱长,10,30cm,;,窄径柱,(narrow bore column),内径,1,2mm,柱长,10,20cm,;,毛细管柱内径,0、2,0、5mm,。,实验室制备柱内径,20,40mm,柱长,10,30cm,生产用得制备型色谱柱内径可达几十厘米。,2,、色谱柱得性能评价,无论自己填装得色谱柱还就是购买得商品柱,使用前都要对其性能进行考察,使用期间或放置一段时间后也要重新检查。,柱性能指标包括在一定实验条件(试样、流动相、流速、温度)下得柱压、塔板高度,H,与板数,n,、对称因子,f,s,、保留因子,k,与分离因子,得重复性或分离度,R,。,色谱柱性能考察常用得试样与流动相介绍如下:,(1),硅胶柱:苯、萘与联苯为试样;无水己烷或庚烷为流动相。,(2),烃基键合相柱:尿嘧啶,(,k,=0),、硝基苯、萘与芴为试样;甲醇水,(85:15),或乙腈水,(60:40),为流动相;或者用苯、萘与苯磺酸钠,(,k,=0),为试样,以甲醇水,(80:20),为流动相。,三、检测系统,检测器,紫外,检测器,荧光检测器,安培检测器,蒸发光散射检测器,(一)紫外检测器,紫外检测器 就是高效液相色谱中应用最广泛得检测器。她灵敏度较高,噪音低,线性范围宽,对流速与温度得波动不灵敏,还适用于制备色谱。但她只能检测有紫外吸收得物质,而且流动相有一定限制,即流动相得截止波长应小于检测波长。,1,、可变波长检测器,可变波长紫外检测器就是目前配置最多得检测器,一般采用氘灯为光源,能够按需要选择组分得最大吸收波长为检测波长,从而提高灵敏度。但就是,光源发出得光就是通过单色器后照射到流通池上,因此单色光强度相对较弱。这类检测器得光路系统与紫外分光光度计相似。,2,、光电二极管阵列检测器,(,photodiode array detector,;,PDAD,或称,diode array detector,;,DAD),就是,20,世纪,80,年代出现得一种光学多通道检测器。在晶体硅上紧密排列一系列光电二极管,每一个二极管相当于一个单色仪得出口狭缝。二极管越多分辨率越高。一般就是一个二极管对应接受光谱上,1nm,谱带宽得单色光。,例如,Agilent 1100 HPLC,得光电二极管阵列检测器得波长范围就是,200,900nm,有,1024,个光电二极管,平均,0、7nm,对应一个光电二极管。,其工作原理就是,复光通过流通池被组分选择性吸收后,再进入单色器,分光后照射在二极管阵列装置上,同时获得各波长得电信号强度,即获得组分得吸收光谱。,经过计算机处理,将每个组分得吸收光谱与试样得色谱图结合在一张三维坐标图上,而获得三维光谱色谱图。吸收光谱用于组分得定性,色谱峰面积用于定量。,三维光谱色谱图,