微生物工程重点内容.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物工程的基本概念,利用,微生物,的特定性状和机能，通过现代化工程技术，,生产有用物质,或,直接应用于工业化生产,的技术体系；是将传统发酵与现代基因工程、细胞工程、代谢工程、生物信息工程和计算机控制等新技术结合并迅速发展起来的现代发酵技术。,微生物工程是渗透有工程学的微生物学，是发酵技术工程化的发展。,涂活乳仲磐洼屈盲舵档凝靛甥奢遗定稳烟宋蜀剑增毁釜肪贯龟骤吩忿稻童微生物工程重点内容微生物工程重点内容,微生物工程发展简史,1、传统的微生物发酵技术天然发酵,2、第一代微生物发酵技术 纯培养技术,3、第二代微生物发酵技术深层培养技术,4、第三代微生物发酵技术,代谢调控技术,5、第四代发酵技术基因工程技术,荫炯痢栓奏进嫡录汪咱贱劈娶境颓焦心惕炽鸟痹挛寓涵山法设谨寂松上阶微生物工程重点内容微生物工程重点内容,微生物工程,微生物工程既基于,生物学知识、,又依托,工程概念,，解决的是生物技术,产业化,进程中的关键问题，被誉为工业生物技术的核心。,借助于,微生物,进行,产品开发,或,环境改造,是微生物工程 的基本内容和目标，涉及到解决人类所面临的,食品与营养,、,健康与环境,、,资源与能源,等重大问题，为人类社会带来巨大经济和社会效益。,驾影担具埠油扯沥卧劣堤邀漏涵虎停荤禽踏职肿赛晕墅疮载页榜续踏味睛微生物工程重点内容微生物工程重点内容,微生物工程的组成,微生物学,化学工程,生物化学,堡酉颤莹胺托痕葡栽瑚酉化晚掠肆猾检邢彻灿秩牺抵封翰现硫且顽畏牧窟微生物工程重点内容微生物工程重点内容,菌种的选育,培养基的配制、灭菌、,扩大培养和接种,发酵过程,产品的分离提纯等,微生物发酵生产流程,硼防呻戒坪侵因昌澜碑串订湾殃进厘刚捆焕季胁柏仁苞忆伤范涨霜泅衷枯微生物工程重点内容微生物工程重点内容,微,生物工程产品类型,1.微生物代谢产物发酵,2、微生物菌体的发酵,3、微生物的生物转化,舟诽效垒娩炙图氨辱合沏适负屠捻摆鲍币挎哟檄充迎刑椭社初撤真乖绩颠微生物工程重点内容微生物工程重点内容,初级代谢产物,与菌体生长相伴随的产物，,氨基酸、核苷酸、维生素、有机酸、溶剂,菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累,次级代谢产物,与菌体生长不相伴随，以初级代谢产物为原料而合成,抗生素、生物碱、毒素、胞外多糖等,结构常较复杂,对环境条件敏感,1.微生物代谢产物发酵,发酵生产产品的类型 目的,睛磋雁福喀氰氓操投剖构丧膘菱皑赣隔答友击朝酥吨梁缉巳挣精璃蹋貉敖微生物工程重点内容微生物工程重点内容,初级代谢产物,primary metabolite,是指,微生物,通过,代谢,活动所产生的、自身生长和繁殖所,必需的,物质，如,氨基酸,、,核苷酸,、,多糖,、,脂类,、,维生素,等。通过,初级代谢,，能使营养物转化为结构物质、具生理活性物质或为生长提供能量，因此初级代谢产物，通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止，重则导致机体发生突变或死亡，是一种基本代谢类型。,姚瀑斩潭蛰晶痞犹堪盔侩冉毗李瞎勺镀太邦僵刻没苹琶饭诗掸驭凉产畜拎微生物工程重点内容微生物工程重点内容,次级代谢产物,secondary metabolite,是指,微生物,生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或,并非是,微生物生长和繁殖所必需的物质，如,抗生素,、,毒素,、,激素,、,色素,等。不同种类的微生物所产生的次级代谢产物不相同，他们可能积累在细胞内，也可能排到外环境中。,伴员疥猎鸭砒祭胃陇捎扔篓棉疏文貉表魂灸逼蝎猴琵潍念瞄刽蔡硷酸粹咸微生物工程重点内容微生物工程重点内容,2、微生物菌体的发酵,SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）,生物防治制剂（如苏云金杆菌）,活性乳酸菌制剂、食用和药用酵母,细胞的生长与产物的积累成平行关系，,生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段,琉粱械照认各喝止地请诸艳塘谢宗迪寓罢井真赖渴俘群玩诛表眼瓣仆哭躯微生物工程重点内容微生物工程重点内容,3、微生物的生物转化,利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的特定部位进行加工，如,加入羟基、还原双键、脱氧或切断支链,等。,转化的最终产物并不是微生物细胞利用营养物质经细胞代谢产生，而是微生物细胞的酶或酶系作用于底物的某一部位，进行特定部位的化学反应而形成。,反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、,结构位置特异性、立体特异性,炬赘榔札曙垮僚缅驮鸥私陋放抛铺借缮呈桌伊邀凡俩奋硷宛纯害呼并铱啦微生物工程重点内容微生物工程重点内容,4）微生物特殊机能的利用,利用微生物消除环境污染,利用微生物保持生态平衡,利用微生物探矿、冶金、石油脱硫等（氧化硫杆菌、排硫杆菌、脱氨硫杆菌、氧化亚铁硫杆菌（如芽孢杆菌属、土壤杆菌属）等。）,利用基因工程菌生产动、植物细胞产品,泌楚激团顺厘春施孵诲拖删叮丢吼孟掐祟俺焦陈恩杂政庚邀册漫珠鸦逸答微生物工程重点内容微生物工程重点内容,工业微生物的特点,1、概念(什么是工业微生物),从来源于自然界大量的微生物中分离并筛选出有用菌种，再加以改良，贮存待用于生产的微生物称为工业微生物,。通常在发酵过程作为活细胞催化剂,传统的工业微生物包括,细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。,目前最有应用前景的工业微生物：,基因工程菌株,嗣鳞和畜鹰躺生譬禄区饭沫半擒睦逾灼币瘫负午樱忿叁樊菠玫蒙鸭忍影居微生物工程重点内容微生物工程重点内容,2、工业微生物种类,2.1 原核细胞类微生物:细菌、放线菌、立克次氏体、衣原体等,2.2 真核细胞类微生物,:,酵母菌和霉菌，单细胞藻类、原生动物等,2.1 非细胞类微生物（主要作为基因工程的载体）,:,RNA病毒（逆转录病毒）DNA病毒（腺病毒）,3、微生物的特点,3.1 种类多 3.2 分布广 3.3 体积小,3.4 繁殖快 3.5 代谢强 3.6 易变异,盯链眨考晨妒肯章蹲谅吼搁肇似奇抠坷野盖舶完职菠绷礁痪廷痪朽豪浸塘微生物工程重点内容微生物工程重点内容,（1）,廉,价原料、生长迅速、目的产物产量高。,（2）,易,于控制培养条件，生产效率,高,。发酵周期较短。,（3）抗杂菌和噬菌体的能力,强,。,（4）菌种遗传性能,稳,定，不易变异和退化，,不产生任何有害的生物活性物质和毒素，,保证安全生产。,（5）产品容,易,分离提纯。对,于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细胞不易发生菌体自溶；对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎。,二、工业化菌种的要求,照拨申佃暮任鹰迢评部璃颐苍居垫谚糙感坐陶骋纤离黎致稀掌芋蒜皑邻汝微生物工程重点内容微生物工程重点内容,微生物与工业生产,二、人类是如何利用微生物进行工业生产的呢？（通过微生物工业生产想获得什么？）,1.获取,菌体物质,，例如蛋白、脂肪和糖类。,2.获取微生物的,代谢产物,，例如抗生素、乙醇、甘油等等。,3.利用微生物的,酶,作为活化剂进行产品加工。,跳番秋楚脾赡藉累嘲壹把硫陪叶茎克箍更卷琅语郡暴史敬糕晤汛镁求竹妊微生物工程重点内容微生物工程重点内容,基因工程菌与传统工业微生物的差别,前者含有带,外源基因,的重组载体;而后者是单一的微生物细胞;,前者需要发酵条件,满足外源基因,的表达，后者则只需要满足细菌本身的生长和代谢需要,要获得高水平的产品，基因工程菌生产过程中往往使用,高密度发酵,基因工程菌发酵问题中最重要的两个问题是菌体的高密度发酵和诱导条件的确定。,炔耽氖汗臀坎雌惺避野砚巳谩盲乖昆阁莉州迢争只凛敞卯蚜咨树娩囊斩背微生物工程重点内容微生物工程重点内容,培养基的主要成分及作用,一、碳源,主要功能：,1）为菌体的生长繁殖提供能源和合成菌体所 必需的成分；,2）为合成目的产物提供所需的碳素成分,擦址做闷喳滚推嘴匀屁抬茬感痉挡肘澡辅署骋适粒归藩瓦扔塌谩欢蓖歉哄微生物工程重点内容微生物工程重点内容,常用的碳源:,特殊情况下（如碳源贫乏时），蛋白质水解物或氨基酸等也可被微生物作为碳源使用。,糖类,发酵培养基中使用最广泛的碳源;,主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉糊精等,油脂,这些微生物都具有比较活跃的脂肪酶，在脂肪酶的作用下，油或脂肪被水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，进一步氧化成CO2和H2O，并释放出大量的能量。,当微生物利用脂肪作为碳源时，要供给比糖代谢更多的氧，不然大量的脂肪酸和代谢中的有机酸会积累，从而引起pH的下降，并影响微生物酶系统的作用。,常用豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等,有机酸,一些微生物对多种有机酸（如乳酸、柠檬酸、乙酸等）有很强的氧化能力，可以有机酸或有机酸盐作为碳源。,有机酸的利用常会使pH上升，尤其是有机酸盐氧化时，常伴随着碱性物质的产生，使pH进一步上升。,低碳醇等,仔作孵阀迹粱丧氖脊奶巧苞淮惺雄掌垛扁未燥糜皋懦痉特犊戊嫡磨它虫衡微生物工程重点内容微生物工程重点内容,二、氮源,有机氮源,：,豆饼（粕）粉、花生饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵母粉、玉米浆、尿素等,无机氮源：,铵盐、硝酸盐等（由于细胞内的含氮物质都以氨基或亚氨基的形式存在，故铵态氮可以直接用于合成细胞物质；而硝态氮需还原成氨后才能被利用）,分类：无机氮源和尿素、玉米浆等可被迅速利用，为速效氮；,蛋白质氮则需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用，,属迟效氮,氮源物质常对培养液pH产生影响,在常用的无机氮中，硫酸铵被菌体利用后会使培养液的pH下降，为生理酸性物质；,硝酸钠被同化时则引起培养液pH上升，为生理碱性物质,常殆邦诗竭抓该俩颜偷纶拭铺蜂涅玩谎菩橙贵豫专血疆荣涤哎雇炬吭生乔微生物工程重点内容微生物工程重点内容,三、无机盐和微量元素,磷酸盐：,磷是某些蛋白质和核酸的组成成分,磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用,微生物对磷的需要量一般为0.0050.01mol/L,常用K3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4,钾盐：,钾不参与细胞结构物质的组成,是许多酶的激活剂,菌体生长所需钾量约为0.1g/L(以K2SO4计),微量元素,：,需量微少，但又不可缺少,一般作为碳、氮源的农副产物天然原料中，本身含有，不必另加,某些金属离子，特别是汞离子和铜离子，具有明显的毒性,辗吴哮灼今蝗芍潘单傣写投华盗编裹林地捷解茹樊雾鸯给雷厌儒糜泪修哭微生物工程重点内容微生物工程重点内容,硫酸镁：,Mg 2+是许多重要酶（如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂,镁离子能提高一些氨基糖苷类抗生素产生菌对自身所产的抗生素的耐受能力，如卡那霉素、链霉素、新生霉素等产生菌。,硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分,硫是构成一些酶的活性基,硫酸镁加入培养基中，在碱性条件下会形成氢氧化镁沉淀，配料时要注意。,染支砾滴糖缉柏梦嚎但亨佃秩畴罐愈接派验抗轩沂啃王缠镣暮岿反础牙攻微生物工程重点内容微生物工程重点内容,四、生长因子,概念：,微生物生长不可缺少的微量有机物质。,类别：,维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍物,提供生长因子的农副产品原料,1）玉米浆 用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩液，也是玉米淀粉生产的副产品 虽然主要用作氮源，但它含有丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，常用作为提供生长因子的物质。,2）麸皮水解液：,可代替玉米浆，蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。用量一般为1%（以干麸皮计）左右,3）糖蜜 甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜均可代替玉米浆，但氨基酸等有机氮含量较低,甘蔗糖蜜用量为0.1%0.4%,4)酵母,：,酵母膏、酵母浸出液、酵母粉,5）其他：牛肉膏、蛋白胨、动物心、肝等组织浸液等都含有丰富的生长因子,穆翁播上阵季厢克顺途谷力地管誓劳祟眨凸癣圾跑吱敌休嫁区歇遭纪小姓微生物工程重点内容微生物工程重点内容,五、水,生理功能：,1）是微生物机体的重要组成部分,2）进行代谢反应的介质,3）营养物、代谢物、氧气等必须溶解于水后才能通过细胞表面进行正常的活动；,4）水的比热高，能有效吸收代谢过程中放出的热，使细胞内温度不致骤然上升；同时水又是热的良导体，有利于散热，可调节细胞温度。,嘛赛蚊躺句敖禹处骆校宠议帮触彰讣待冬掳嗡阵惑匝斧裙哀冯勉竹主哼谬微生物工程重点内容微生物工程重点内容,1、培养基分类：,按培养基成分,1）合成培养基：,所用原料的化学成分明确、稳定 如葡萄糖、硫酸铵,适于研究菌种基本代谢和过程的物质变化等科研工作；在生产某些疫苗的过程中，为了防止异性蛋白质等杂质掺入，也常用合成培养基；,营养单一、价格较高，不适于大规模生产,2）天然培养基：,原料是一些天然动、植物产品 如花生饼粉、蛋白胨等,来源广泛（大多为农副产品）、营养丰富、价格低廉、适于工业化生产,一般不需要另加微量元素、维生素等物质,由于成分复杂，不易重复，如对原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性,3.半合成（组合）培养基：,在合成培养基的基础上添加些天然成份，以更有效地满足微生物对营养物的需要,如马铃薯-蔗糖培养基,腻孵牲腔桌炒漫蚁叁拎井纯乃囤葛泛烤颈娇论叔愁毯裹姿脊疙擅沈砍旋抄微生物工程重点内容微生物工程重点内容,3、,根据培养基用途来分,基础培养基,富集培养基,选择培养基,鉴别培养基,按生产工艺来分,孢子培养基,种子培养基,发酵培养基,额旬舌都彭佰不榷覆儒霹闭塔仆怨朽生属联骄肌唐小剂贡踪韭堑喂萝瘁竞微生物工程重点内容微生物工程重点内容,1）孢子培养基：,供菌种繁殖孢子的培养基，常用固体培养基。,孢子培养基基本要求：,基本要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质孢子，且不易引起菌种发生变异。,配制时需注意,A）营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子。B）所用无机盐的浓度要适量，否则会影响孢子量和孢子颜色。C）注意pH和培养基的湿度。,常用孢子培养基,麸皮培养基 小米培养基 大米培养基 玉米碎屑培养基 用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制的琼脂斜面培养基,注意：,大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮量少、疏松、表面积大，是良好的孢子培养基。,2）种子培养基：供孢子发芽、生长和菌体繁殖的培养基。,营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。,种子培养基的成分要考虑在代谢过程中能维持稳定的pH，其成分还要根据不同菌种的主要特征而定。,3）发酵培养基：,供菌体生长、繁殖和合成大量代谢产物用的培养基。,要使种子接入后能迅速生长，达到一定的菌体浓度又要使长好的菌体能迅速合成所需产物。因此发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂等。,袄知孺溪呀烙篙梧舜哥喊技舅床摄奋墒客贝脱眶惜咋赚碾睁论梆班桶蓉庐微生物工程重点内容微生物工程重点内容,基础培养基：,是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养成分的培养基；,加富培养基：,在基本培养基中加入某些特殊的营养物质，如血、血清、动植物组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基。,富集培养基：,用来,富集（使数量上占优势）,和分离某种特定微生物或用以培养营养要求苛刻的微生物.,选择培养基,：,具体说，是,加入相应的特殊营养物质或有抑菌性的化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,而促进所需微生物的生长。,用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中,分离出来.,鉴别培养基：,用于鉴别不同类型微生物的培养基。,在普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的,指示剂或化学药品,，从而产生某种明显的,特征性变化,，以区别不同的微生物以便于根据目的选择性挑取或计数等。,搓躁夯晌勉灸糠浇慢孙位丁劣谅轮屿垒直兜业短羚痕码绞誊攒款弱戒鸦蚌微生物工程重点内容微生物工程重点内容,小结,培养基的类型 分类依据 类型 营养物质来源 天然、合成、半合成 培养基物理状态 液体、固体、半液体 培养基的成分和目的 基本、完全、鉴别、选择 生产工艺的要求 孢子(Spore)、种子、发酵,培养基的用途：筛选菌种、保藏菌种、检验杂菌、培养种子、发酵生产等,性宙罕抖刺始亚晚厕阿夜躁寒聘赢眶烈珍舒寞晃氖知撞兑刹湖仓刹矛弱军微生物工程重点内容微生物工程重点内容,巴斯德效应 Pasteur effect,1861年巴斯德(L.Pasteur)在研究酵母的酒精发酵量和氧分压之间的关系中发现,在厌氧条件下,向高速发酵的培养基中通入氧气,则葡萄糖消耗减少,抑制发酵产物积累的现象称为巴斯德效应。即呼吸抑制发酵的作用。,在好氧条件下，,酵母发酵能力下降。,磷酸果糖激酶，是变构酶，受ATP，柠檬酸及其他高能化合物抑制，被AMP,ADP激活；在好气条件下，糖代谢进入TCA，产生柠檬酸并通过氧化磷酸化生成大ATP，细胞内柠檬酸生成增加，反馈抑制磷酸果糖激酶的合成，阻遏作用由于ATP反馈抑制此酶的活性而加强；,由于磷酸果糖激酶受抑制，导致6-磷酸果糖积累，当反应6-磷酸葡萄糖6-磷酸果糖达到平衡，醛糖和酮糖的摩尔比=7:3，导致6-磷酸葡萄糖积累，反馈抑制己糖激酶，抑制葡萄糖进入细胞内，导致葡萄糖利用率降低；,好气条件下丙酮酸激酶的活性降低，此酶受磷酸果糖激酶催化生成的1,6-二磷酸果糖的激活，丙酮酸激酶活性降低，导致磷酸烯醇丙酮酸积累，反馈抑制己糖激酶；,畴丫芒独凋湍吞携睹陈贸伤旅程浩排涤奖哼汰揪迸横斜靠指小悯镀熏蔗虫微生物工程重点内容微生物工程重点内容,在厌氧发酵过程中，丙酮酸在不同的受氢体的作用下产物会不同，也就是说在不同酶的催化下会获得不同的产物，都有哪些酶和哪些产物？,乳酸脱氢酶-乳酸,丙酮酸脱羧酶-乙醛-乙醇脱氢酶-乙醇,丙酮酸脱氢酶-乙酰CoA-丁酰 CoA丁醛-丁醇丙酮,蔫卿焰聂抒莉泵凝峰垛盏早背实睛犁排留茧帕恿双宏和俏据寓鸦扬溯郴刨微生物工程重点内容微生物工程重点内容,什么是好氧发酵和厌氧发酵，其主要代表产品有哪些,好氧发酵：,发酵时需要氧的参与，而且在氧气充足的条件下发酵效率更高,代表产品：链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素,厌氧发酵：,发酵时不需要氧的参与，氧气可能会对发酵产生不良影响,代表产品：酒精、丙酮、丁醇、甘油,晦驾攒誓缝匈澎酶詹沈髓岩暖蓖歹黑些匈论批玄芦阜违旧条舌杂央撮浅夯微生物工程重点内容微生物工程重点内容,A.亚硫酸盐法甘油发酵（酵母第二型发酵）,C,6,H,12,O,6,+NaSHO,3,2CH,2,OHCHOHCH,2,OH+CH,3,CHOHOSO,2,Na+CO,2,祭勾窜孕甥妆斗逢捧厨良乾菜榜匈粪菇缠邻叉浪瑞凹枉甫扦犬迹同颠去衰微生物工程重点内容微生物工程重点内容,在酵母中，乙醇脱氢酶活力很强，在该酶的作用下，乙醛作为受氢体而被还原成乙醇，因此，在乙醇发酵中，甘油生成量很少。如果改变发酵条件或者加入某种抑制剂，阻止乙醛作为受氢体，就可以积累大量甘油，如在发酵醪中加入,亚硫酸氢钠，与乙醛起加成反应生成难溶的乙醛亚硫酸氢钠加成物。,这样乙醛不能作为受氢体，必须有,磷酸二羟丙酮,作为受氢体，生成大量甘油，即转为甘油发酵，也叫做酵母第二型发酵。,厢笨祭番崭感瞪隧臀括笋笆涅扭塔城计稗依以审殖莱何癸蛛砚励寿忻携砾微生物工程重点内容微生物工程重点内容,B.碱法甘油发酵(酵母第三型发酵),2C,6,H,12,O,6,+H,2,O2CH,2,OHCHOHCH,2,OH+C,2,H,5,OH+CH,3,COOH+2CO,2,尉震陡进蚜凝绥磋酞社隘博挨肪屡得卧斥锦望剔犯煽健芭盅砾辟跪循玻绿微生物工程重点内容微生物工程重点内容,当酵母在,碱性（PH7.6）条件,下进行发酵，所生成的乙醛也不能作为受氢体，,两个乙醛分子起歧化作用，相互氧化还原，生成等量的乙醇和乙酸，,这时，,硫酸二羟丙酮又成为NADH+H+的受氢体，,总的产物为,甘油，乙酸，乙醇，和CO2.,峨峰粒掌神岭皂本摔序凹期拽赘南拖隆壁紫渤幼洱黑梆菩书皆则关吐编蝇微生物工程重点内容微生物工程重点内容,总反应式为:,C,6,H,12,O,6,+2ADP+2H,3,PO,4,2CH,3,CHOHCOOH+2ATP+135.56KJ,理论转化率:,290/180100%=100%,乳酸链球菌、酪乳杆菌、,保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌,同型乳酸发酵是指发酵终产物中90以上为乳酸的乳酸发酵过程。,同型乳酸发酵,(Homofermentation of lactic acid patheay),糖酵解途径（EMP）,丙酮酸脱氢酶,府腑是理距泵诸锣吮绩鳞猪耐挛糙俞峰毕炒截织舵赃扇腊刘棠辟非炔柱午微生物工程重点内容微生物工程重点内容,异型乳酸发酵,Heterofermentation of lactic acid patheay,总反应式为:C,6,H,12,O,6,CH,3,CHOHCOOH+CH,3,CH,2,OH,理论转化率:,90/180100%=50%,磷酸戊糖途径（HMP),肠膜明串珠菌、葡聚糖明串珠菌,是指发酵终产物中除乳酸外，还有乙醇、乙酸和二氧化碳等成分的乳酸发酵过程。,磷酸解酮酶,狭范销俏唁椿露玉靴掺二猪松坚钳桑壳种们伤躯病鸿碟蔫仅殷顷棵怕甚余微生物工程重点内容微生物工程重点内容,双歧途径,Bifidum patheay,总反应式为:,2C,6,H,12,O,6,2CH,3,CHOHCOOH+3CH,3,COOH,理论转化率:,(290)/(2180)100%=50%,磷酸解酮酶途径（HK）,6-磷酸果糖酮解酶,5-磷酸木酮糖磷酸酮解酶,唱应豪旧磊汲整迄宦讹绣堆胁番液嗅撑瞻药吮亏霉瞧讶匈不挺伊漳龚陡骗微生物工程重点内容微生物工程重点内容,柠檬酸生物合成途径,丙酮酸羧化酶,丙酮酸脱氢酶,柠檬酸合成酶,馅丛迸泊漱留刽杖借己赣郑淖赶亿悲韭蔓患咳篷孺三处另团占怨狮彼分睛微生物工程重点内容微生物工程重点内容,第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK）,柠檬酸和ATP对该酶有抑制,生产菌需要解除该抑制作用,AMP、无机磷以及NH,4,+,对该酶有活化作用,NH,4,+,有效解除柠檬酸和ATP对该酶的抑制，,NH,4,+,浓度与柠檬酸生产速度有密切关系，正是细胞内NH,4,+,浓度升高，使PFK对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。,故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量,磷酸果糖激酶,1.糖酵解及丙酮酸代谢的调节,只朋傈单矿吐缘烙炉堡虞甫链淮壶果谜卫炼赏酸哀普绞氏祝趴房惩恋树纤微生物工程重点内容微生物工程重点内容,Mn,2+,的影响：,Mn,2+,缺乏,HMP和TCA循环酶水平低，生长期菌丝体的蛋白质、核酸和脂肪含量明显减少，氨基酸和,NH,4,+,水平升高,Mn,2+,缺乏,可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解,NH,4,+,水平升高,减少柠檬酸对PFK的抑制,Mn,2+,缺乏,高糖,NH,4,+,Glu,Gln,Orn,Arg,氨基丁酸,蛋白质和RNA转换过程中细胞蛋白的再合成受损伤,1.糖酵解及丙酮酸代谢的调节,砷颐璃撤淖静僧皿荫盆值帘臼蝴先翔哉岭帖字梨您筑所滓巾浚们结住鞋俩微生物工程重点内容微生物工程重点内容,丙酮酸羧化酶和丙酮酸脱氢酶的平衡,1.糖酵解及丙酮酸代谢的调节,丙酮酸羧化酶,丙酮酸脱氢酶,县户蹄扶淫敬涛改慰锥除倔并垄筑匣蝗赌疼负可炙始笋论合党半钙扳函阵微生物工程重点内容微生物工程重点内容,柠檬酸合成酶是TCA循环第一个酶。,但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。,大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键。,丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制,或其控制及微弱，,而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸,的提供，增加了柠檬酸的合成能力。,2.三羧酸循环的调节,柠檬酸合成酶,臆恨个儒撇呸汝巨咽煤晚孺中踌明逐舞琢丛枯经夯杭颅挣喉京鹰币蒜徐馆微生物工程重点内容微生物工程重点内容,顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸-顺乌头酸正逆反应的酶，作用需要Fe,2+,。,（1）添加,Fe,2+,络合物,（2）筛选该酶缺失或活力降低的菌株,（3）随着柠檬酸的积累，高酸环境可进一步造成顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活,2.三羧酸循环的调节,顺乌头酸水合酶,膏语晓偶诧再瓶眠丙邑石绵愈阶厌言于仓累均钧我痘免保署辙枝烦诸竖聊微生物工程重点内容微生物工程重点内容,2.三羧酸循环的调节,NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶,黑曲霉中只有一种NAD-异柠檬酸脱氢酶，且活力很低。NADP-异柠檬酸脱氢酶有两种：,（1）细胞质中的不受柠檬酸抑制,（2）线粒体中受生理浓度柠檬酸抑制。,一旦柠檬酸积累到一定水平，就能抑制其自身的进一步,分解，从而促进自身的积累,懊铁忽喝萨光葵馁萝彭饼榷伞看室黄呐撵朴镰味埂梁识寺荆儡舰瓮脊磨惟微生物工程重点内容微生物工程重点内容,2.三羧酸循环的调节,-酮戊二酸脱氢酶,在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特点是，-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和,NH4,+,的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。,-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可逆反应，一旦-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：,TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循环生成，使TCA循环成,“,马蹄形,”,。,-酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。,暑发零冰菲膘挖忻蒋慕豆尊毙豹贡儒庐劫齿晓角癣且寒戍悦潘云鸦著束挞微生物工程重点内容微生物工程重点内容,乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：,(1)氧是发酵过程生成的NADH,2,重新氧化的氢受体。,(2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。,2.,三羧酸循环的调节,-,氧对柠檬酸积累的调节,暇劫捍衡疽卒聋佳辊阑悍发国戊笋狡隧购粪犹识啊冒煮咨绥纳卧纯窘绿靶微生物工程重点内容微生物工程重点内容,当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。,2.三羧酸循环的调节,氧对柠檬酸积累的调节,分糙亭街胞趣共纽最训蹲庸测凋蛔按感絮绰儿惮驮秀践暇甲呻节穗皮铀菏微生物工程重点内容微生物工程重点内容,柠檬酸的积累机制小结：,Mn,2+,缺乏抑制蛋白合成NH4,+,，形成一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链，,解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径畅通。,丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，草酰乙酸合成有保证。,丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO,2,的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。,定约碱尸充肄摈搁钾帕图氮滥毒纫岸猫蛔酒泡汁咳铰渭贩窟蓉雕枕峪柿闹微生物工程重点内容微生物工程重点内容,柠檬酸的积累机制小结：,顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7，同时控制Fe,2+,含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。,随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。,誊耳绍亏蝉口愉桅闰蹬堵撒帐烧内鬃阮蹄疙试烟茹芬值差检脯懒案安嘴渴微生物工程重点内容微生物工程重点内容,柠檬酸的积累机制小结：,-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和NH,4,+,的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。,-酮戊二酸抑制异柠檬酸脱氢酶的活性，促使柠檬酸的积累,躁拽唉异坟赔王倘萌冕话佬烂塌形毗脖锨鹏浮孜熔其痊抛讨姐佃课受觉般微生物工程重点内容微生物工程重点内容,柠檬酸发酵过程的控制要点,（1）控制Mn,2+,、NH,4,+,浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制，使EMP畅通无阻。,（3）控制培养基中的Fe,2+,的浓度，使顺乌头酸水合酶失活。,（2）,控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。,闭芍唇迂赶剃脐这握赖吸闪埃饱关扫孽洽长胺爽抉茁坟汽翼玛乍曰浓吼沮微生物工程重点内容微生物工程重点内容,氨基酸发酵的代谢调控,1控制旁路代谢,2降低反馈作用物的浓度,3消除终产物的反馈抑制与阻遏,4控制细胞渗透性,5控制发酵的环境,6促进ATP的积累以利氨基酸的生物合成,涨焰据周挑偿蚜谅看除菏魄洞妇鞋侧壹绕又骗踞溢碳慰匠舌净沸讶瓢垒沿微生物工程重点内容微生物工程重点内容,一、谷氨酸生物合成途径及调节机制,讶氛庭马生芍祈舔刘仲履甲椽扑啄蹄押栈创羌惋鼻哨眨题桃朔词蹿凛芒懈微生物工程重点内容微生物工程重点内容,3mol醋酸,：,1mol,柠檬酸,生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸,酵母N源耗尽后开始烷烃发酵，低浓度AMP抑制NAD-异柠檬酸脱氢酶的活性，柠檬酸大量合成并积累。此时顺乌头酸水合酶催化反应平衡为：柠檬酸：异柠檬酸：顺乌头酸 =90：7：3。细胞质中积累大量异柠檬酸。,野芍痛扔渴敬注哼葵徐嘛牢腑殃骆边纂恫乙猛靳丘睹搀倚盎锣裕彤举匡侈微生物工程重点内容微生物工程重点内容,谷氨酸生产菌中存在2个糖酵解途径EMP/HMP,生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度,丙酮酸积累,亚砷酸抑制,EMP途径：HMP途径,90：10,生物素,HMP38%,HMP26%,黄色短杆菌,产氨短杆菌,棍探尤畏歼逸觉障兑图顺壁滴断矽秀瓣朵盂导胀涪疚炒塌名灰皮荧肚购妹微生物工程重点内容微生物工程重点内容,TCA循环,柠檬酸合成酶,乌头酸酶,异柠檬酸脱氢酶,拮抗,氟乙酸,氟乙酸抗性株,谷氨酸产量升高,氟乙酸是乌头酸酶的专一抑制剂,酮戊二酸脱氢酶活力低,酮戊二酸积累,NH,4,+,谷氨酸脱氢酶,谷氨酸,-,酮戊二酸脱氢酶,ATP,库府姚序美卵鹤捡锄喳涕肪窄零扼逞吟绿饿半水犀钙伪研纳袁折悯告泉粟微生物工程重点内容微生物工程重点内容,3C,6,H,12,O,6,6C,3,H,4,O,3,6CH,3,COOH6CO,2,6CH,3,COOH+2NH,3,+3O,2,2C,5,H,9,O,4,N+2CO,2,+6H,2,O,以葡萄糖为原料的谷氨酸发酵中，特别是在谷,氨酸生成期DCA循环应关闭,异柠檬酸裂解酶,TCA循环的中间产物,异柠檬酸脱氢酶,异柠檬酸裂解酶,抑制,黄色短杆菌,Km0.01mmol/L,Km0.8mmol/L,有机酸浓度低时DCA循环,有机酸浓度高时TCA循环,在谷氨酸发酵中，DCA环一方面可以作为TCA循环有缺陷时C4二羧酸的补充,在谷氨基酸生产菌的生长中提供能量,作用,DCA循环,异柠檬酸脱氢酶,国世瘩税窄鹤拽骋竞舆具孺纂止嘶敦敛液腿颤新藐衣扇嗅玖福关谨交邮罗微生物工程重点内容微生物工程重点内容,CO,2,固定,在生产菌中检出CO,2,固定反应酶活性,磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和苹果酸酶,谷氨酸对糖的转化率达到81.7%,PEP,乙酰CoA,草酰乙酸、,PEP羧化酶,丙酮酸激酶,PEP浓度低时乙酰CoA与二磷酸果糖不能激活PEP羧化酶分解,乙酰CoA浓度增加，与二磷酸果糖共同激活PEP羧化酶，CO,2,固定,增加TCA循环中间产物浓度天冬氨酸 反馈抑制PEP羧化酶分解防止草酰乙酸,当乙酰CoA氧化 ATP 丙酮酸激酶抑制CO,2,固定,轴惦割销个摇额榆吩隆灶救栈灶抽趁语斜桂更匀稻斗姥变忱咨铜笺吟渣沂微生物工程重点内容微生物工程重点内容,氨的导入,合成谷氨酸的反应有3种：,+,-酮戊二酸,+,天冬氨酸或丙氨酸,谷氨酸转氨酶,-酮戊二酸,+,-酮戊二酸,+,谷氨酰胺,NADPH,+,2谷氨酸,NADP,+,谷氨酸合成酶,-酮戊二酸,+,NH,4,+,NADPH,谷氨酸,H,2,O,NADP,+,+,谷氨酸脱氢酶,生产菌中,谷氨酸脱氢酶是合成积累谷氨酸的主要酶,谷氨酸转氨酶活力低，转氨作用可以不考虑,谷氨酸合成酶由于不受高浓度谷氨酸抑制，其作用值得重视,谷氨酸,+,-酮戊二酸,+,天冬氨酸或丙氨酸,-酮戊二酸,+,谷氨酸,-酮戊二酸,+,邢纯颁懒轿聪衰光仪厦髓渴翅已谆缠裴眠氮目兼跋椒凉炉残费桅脆咕音荆微生物工程重点内容微生物工程重点内容,为何谷氨酸合成酶在合成谷氨酸过程中值得重视？,谷氨酸合成酶的K,m,NH4+,只有谷氨酸脱氢酶的1/10，当环境中NH,4+,浓度很低时，由该途径合成谷氨酸。,当细胞内谷氨酸浓度高时，反馈抑制谷氨酸脱氢酶活性，但不抑,制谷氨酸合成酶。,辣筑谱畦犹铲昔绸关诧拐亭帐铺页氯奎舶皇腆羌蠕马欢悄埠蜒像流搏鲍鱼微生物工程重点内容微生物工程重点内容,异柠檬酸脱氢酶（NADP）与谷氨酸脱氢酶,（NADPH+H,+,）形成共轭体系，,在活细胞中异柠檬酸脱氢酶活性总比谷氨酸脱氢酶,低,谷氨酸,为何说NADP浓度是限速因子，决定谷氨酸的产量？,佰齐绪旗颖胡郑片悼酉床球返兔抠彝旷田盒擂泻哭猴云靳帚蛊琼贬荣烦阑微生物工程重点内容微生物工程重点内容,生物素和NH4,+,对谷氨酸发酵如何影响？,生物素缺乏，NH,4,+,提高糖代谢速度,高效合成谷氨酸,生物素充足时，NH,4,+,不影响糖代谢速度,缄匹兼逸远损哮攘祭吧僧埂剪险禹纶耀轿厚弛部玄替蔼彻火俘杀耪蜕站桐微生物工程重点内容微生物工程重点内容,细胞膜通透性控制,结论：谷氨酸分泌是由细胞膜控制的。,结论：细胞膜的谷氨酸通透性受细胞膜的,磷脂含量控制,唯邹乾程呵窘礁蛔意幂袍莉掳珍崔疏卿观卫柠凤顷壤鸭函品血飘尸干仿劫微生物工程重点内容微生物工程重点内容,菌种选育模型,细胞膜通透性,细胞膜磷脂含量,控制油酸合成,控制甘油合成,控制磷脂合成,唾疼班延费骡陛宫睫蔓瓷瘴订周揣项谬雹却回健本神储萤匆阅木识瞒坛镰微生物工程重点内容微生物工程重点内容,生物素缺陷型,阻断不饱和脂肪酸的合成,磷脂含量减少，影响细胞膜的合成,饱和脂肪酸表面活性剂,对生物素有拮抗,阻断脂肪酸的合成,影响细胞膜的合成,在对数生长期添加青霉素,抑制细胞壁合成,细胞膜损伤,甘油缺陷型,磷脂的合成受阻,影响细胞膜的合成,油酸缺陷型,阻断不饱和脂肪酸的合成,影响细胞膜的合成,菌种选育模型,蛙弗榷墨框嫂口呀柱微止垣缅脚温迎泅恰骚擂驱单颓咋刊臻燎锻泰启荧劲微生物工程重点内容微生物工程重点内容,(1)细胞生长期到抗生素产生期的过渡,次级代谢产物是在菌体生长到达相对静止期才产生。在细胞生长阶段,负责次级代谢产物合成的酶处于抑制状态。,A.诱导因子在生长期末积累或从外源加入;B.初级代谢的终产物耗尽解除反馈阻遏作用;C.易被利用的糖源分解代谢物被利用后,便解除了阻遏作用;D.高能化合物ATP形成减少后，阻遏作用也就解除;E.在生长期，RNA聚合酶只能启动生长期基因的转录作用；当生长停 止后,酶的结构改变,允许RNA聚合酶启动生产期基因的转录作用,负责抗生素合成的酶开始生成。,抗生素生物合成的调节机制,淄耐憋述弄咙打晶匣百阔吮瞳徽靡瓮涩哺运痹盲沽植抉拖池磋润欣枉弄愧微生物工程重点内容微生物工程重点内容,(3)分解代谢产物的调节控制,碳、氮分解代谢产物(如葡萄糖)阻遏和抑制作用,抑制抗生素合成。,在抗生素发酵过程中，若供给高浓度的无机氨态氮或其他容易被利用的氮源，会促进菌体生长，强烈抑制抗生素的合成。,葡萄糖效应,glucose effect,(2)酶的诱导作用,在抗生素合成期,参与次级代谢的有些酶是诱导酶。需要,底物或底物的结构类似物,(外源和内源诱导剂)。,禁君蝎读核疵恿氛蜕选帘掘牟林太芭纱阿涯壁芥睫史资当帆磺钱俏论寿僧微生物工程重点内容微生物工程重点内容,(3)分解代谢产物的调节控制,解除分解产物阻遏的方法:,A.选育对葡萄糖代谢产物类似物抗性突变型;B.培养过程中利用缓慢的碳源和氮源,连续流加葡萄糖和无机氨态氮;,C.使用含有慢慢向培养基内渗透营养物质的颗粒。,洛袜讲堂康殊雁富俘劣蒸吹闰缆匀斟床给镁碟马挺汪剪徊棱定刚纫蔡温蔓微生物工程重点内容微生物工程重点内容,（4）磷酸盐的调节,1抗生素只有在磷酸盐含量控制在生长的“亚适量”,时才能合成。,2磷酸盐抑制抗生素合成的机制可能有以下方面：,A.抑制或阻遏抗生素生物合成途径中有关酶的活,力和合成。,B.改变代谢途径。(HMPEMP，减少抗生素的,芳香族前体合成),C.磷酸盐可调节细胞内ATP的形成。,基寝幕萧淹超顶缅埔充胺疲州键亨藩捐想驾傀烙意蔼乐笨痈诲证吭笋猪砂微生物工程重点内容微生物工程重点内容,(5)初级代谢产物的调节,A.有一条共同的合成途径,当初级代谢产物积累时,反馈抑制了某一步反应的进行,而最终抑制了次级代谢产物的合成。,B.初级代谢产物直接参与次级代谢产物的生物合成,反馈抑制了它自身的合成时,必然也同时影响了次级代谢产物的合成。,如缬氨酸是合成青霉素的前体，其生物合成受到反馈调节，必然对青霉素的合成有影响