食品中维生素类的分析.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第五节 食品中维生素类的分析测定,维生素（,vitamin,）的种类很多，按其溶解性质可分为水溶性维生素和脂溶性维生素两大类。,水溶性维生素有维生素,B,族和维生素,C,（抗坏血酸,ascorbic acid,）。,维生素,B,族包括：,V,B1,（硫胺素,thiamin,）、,V,B2,（核黄素,riboflavin,）、,V,B3,（泛酸,pantothenic acid,）、,V,B5,（烟酸,niacin,、尼克酰胺）、,V,B6,（吡哆醇,pyridoxin,）、,V,B7,（生物素,biotin,）、,V,B11,（叶酸,folic acid,）、,V,B12,（钴胺素）。,脂溶性维生素有：,V,A,（包括,胡萝卜素,carotene,）、,V,D,、,V,E,、,V,K,。,一、水溶性维生素类的测定,（一）理化性质,水溶性维生素都易溶于水，不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在加热情况下，可大部或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响，如维生素,C,对氧、铜离子敏感，易被氧化。所以测定水溶性维生素一般都在酸性溶液中进行前处理。,（二）维生素,B,族的测定 维生素,B,1,、,B,2,通常采用稀盐酸水解，或再经淀粉酶、木瓜蛋白酶酶解，使结合态维生素游离出来，再进行提取。为了去除杂质，可用活性人造浮石、硅镁吸附剂等进行纯化处理。,1,、维生素,B1,的测定 （,1,）,硫色素荧光法,：国标法。原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中能被氧化成一种强蓝色荧光物质,噻嘧色素（硫色素）。硫色素在紫外线照射下，发出荧光，其强度与硫色素浓度成正比，也即与溶液中硫胺素含量成正比。激发波长,365nm,；发射波长,435nm,。样品提取：对于一般样品、高蛋白样品、淀粉质样品处理方法不同，如样品中所含杂质较多，可用柱层析法处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液作测定。,操作过程：试样匀浆或粉碎，称样于三角瓶中,加稀盐酸，放入高压锅中加热水解,加淀粉酶、蛋白酶酶解，过滤得提取液,将提取液加入已准备好的盐基交换柱中，过柱,热蒸馏水冲洗交换柱，去杂质,热酸性氯化钾过柱，收集滤液，即为试样净化液,净化液分别加入,A,、,B,两个反应瓶,避光，,A,瓶中加入氢氧化钠溶液，,B,瓶中加入碱性铁氰化钾溶液，振摇,15s,加,10mL,正丁醇，同时振摇,1.5min,，静置分层,吸去下层碱性溶液，加无水硫酸钠使溶液脱水,上机测定。,（,2,）高效液相色谱法待测样品 色谱方式 检 测 器肉及肉制品 正相液相色谱 荧光检测器米粉 反相键合相色谱 柱后衍生化后 荧光检测器食品 离子交换色谱 紫外检测器米及米制品 反相离子对色谱 紫外检测器,GBGBT5009.84-2003,食品中硫胺素,(,维生素,B1),的测定,.pdf,2,、维生素,B2,的测定 国标第一法为荧光法，第二法为微生物法。（,1,）,荧光分光光度法,原理：样品经酸解、酶解处理使核黄素游离出来，用高锰酸钾和过氧化氢氧化杂质，再经硅镁吸附剂进行柱层析，吸附提取核黄素，最后用洗脱液,丙酮冰乙酸水洗脱并收集核黄素。,V,B2,水溶液呈黄绿色荧光，在,440nm,的激发波长，,525nm,发射波长处可产生最大荧光强度。测定谷物中,V,B2,时最好在样品酸解后，加入一定量的淀粉酶，在,35,40,酶解,15,小时左右，这样有利于结合型的,V,B2,转化成游离型的,V,B2,。,（,2,）高效液相色谱法待测样品 色谱方式 检 测 器食品 反相键合相色谱 荧光检测器肉及肉制品 正相液相色谱 荧光检测器蛋及奶制品 反相键合相色谱 紫外检测器米及米制品 反相离子对色谱 紫外检测器,3,、维生素,B5,的测定 国标方法为微生物法。（,1,）溴化氰比色法,V,B5,与溴化氰结合后可与对氨基苯乙酮（或其它芳香族胺）作用生成黄色化合物，因而可在,420nm,波长处测定光密度，求出,V,B5,的含量。（,2,）气相色谱法 烟酸分子具有羟基，不溶于有机溶剂，不能直接用气相色谱法进行测定，但烟酸经酯化转变成烟酸乙酯或,N2,基烟酰胺之后，可以用气相色谱法进行分离测定。（,3,）高效液相色谱法 利用酸水解法提取,V,B5,，经高效液相色谱分离，测定。,4,、维生素,B6,的测定 国标法为微生物法。（,1,）荧光分析法 样品经硫酸加压水解，采用,CGS,树脂的柱层析分离，以氯化钾的磷酸缓冲液洗脱。洗脱液在二氧化锰和乙醛酸钠溶液存在下，可使,V,B6,的混合物即吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺一次转化为吡哆醛。吡哆醛在氰化钾作用下生成强荧光物质,吡哆醛氰醇衍生物。在激发波长,355nm,，发射波长,434nm,处，测定其荧光强度，就可计算出样品中,V,B6,的含量。,（,2,）气相色谱法,V,B6,与七氟丁基咪唑反应可生成挥发性的衍生物，该衍生物在气相色谱中可以很好地分离。最低检出限,10ng,。气相色谱条件：电子捕获检测器；,3%SE52,，固定相,Chromosorb WHPO,（,3,）液相色谱法 样品水解后上机测定。,C,18,柱荧光检测器：激发波长,290nm,，发射波长,395nm,。,5,、维生素,B12,的测定 （,1,）比色法 样品用浓硫酸和高氯酸钾消化后，样品中的钴与,M,吡啶联腙生成钴的红色化合物，可以进行比色测定，再从钴的含量换算成,V,B12,的含量。注意：样品中存在游离钴离子将使测定结果偏高，可以预先用,8,羟基奎宁,氯仿溶液提取，分离除去。（,2,）,原子吸收分光光度法,维生素,B12,的分子中含有钴离子，占,V,B12,的,4.35%,，采用原子吸收分光光度法可以测定其钴含量，再换算成,V,B12,的含量。,样品预处理：样品用,V,B12,提取液（无水磷酸氢二钠,1.3g,柠檬酸,1.2g,无水焦亚硫酸钠,1.0g,加水至,100ml,）提取，滤液中加入,EDTA,，用氨水调,pH,至,7,，再加入活性炭，振摇，用无灰滤纸过滤，,V,B12,被吸附在活性炭上，将活性炭连同滤纸一起在,600,下灰化完全，用硝酸将残渣溶解，以原子吸收分光光度法测定钴的含量。从钴换算为,V,B12,的换算系数,=22.99,。,GBGBT 5009.217-2008,保健食品中维生素,B12,的测定,.pdf,GBGBT 5009.210-2008,食品中泛酸的测定,.pdf,GBGBT 5009.211-2008,食品中叶酸的测定,.pdf,文章,高效液相色谱法测定蔬菜中,B,族维生素,.pdf,（三）维生素,C,的测定 在食品中,VC,有三种存在形式：还原型抗坏血酸（,2H,，氧化）脱氢型抗坏血酸 二酮古洛糖酸。,1,、,提取方法,食品中的维生素,C,通常采用草酸、草酸醋酸、偏磷酸醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维生素,C,的破坏作用。草酸对维生素,C,有很好的稳定性能；偏磷酸能沉淀蛋白质，澄清提取液，适合于蛋白质含量较高的样品。,2,、还原型抗坏血酸的测定 （,1,）,分光光度法,在乙酸溶液中，抗坏血酸与固蓝盐,B,反应生成黄色的草酰肼,-2-,羟基丁酰内酯衍生物。在最大吸收波长,420nm,处测定吸光度，与标准系列比较定量。非蛋白性样品在乙酸溶液中提取，过滤后上清液供测定；蛋白性样品需再加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液，沉淀蛋白质。,（,2,）,2,6,二氯靛酚滴定法 还原型抗坏血酸可以还原染料,2,6,二氯靛酚。该染料在酸性溶液中呈粉红色，被还原后成无色溶液。在终点时，过量的未被还原的染料在酸性溶液中呈粉红色，因此，在滴定过程中当溶液从无色转变成微红色时，表示还原型抗坏血酸全部被氧化为脱氢抗坏血酸，此时即为滴定终点。,3,、总抗坏血酸的测定,（,1,）,荧光法,：国标第一法。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺（,OPDA,）反应生成有荧光的喹喔啉衍生物，其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。激发光波长,338nm,，发射波长,420nm,。,当食物中含有丙酮酸时，也与邻苯二胺反应生成一种荧光物质，干扰测定。这时加入硼酸。硼酸与脱氢抗坏血酸结合生成硼酸脱氢抗坏血酸螯合物，此螯合物不能与邻苯二胺反应生成荧光物质；而硼酸不与丙酮酸反应，丙酮酸仍可发生上述反应。因此，加入硼酸后测出的荧光值即为空白的荧光值。注意事项：试样用偏磷酸,-,乙酸溶液提取；活性炭加入量要适量，量过多，对抗坏血酸有吸附作用，使结果偏低；空白氧化液中加入硼酸溶液后需在,4,冰箱中放置,2-3h,，使反应完全，否则本底偏高。,（,2,）,2,4,二硝基苯肼比色法：国标第二法。样品中,V,C,用草酸提取，活性炭使提取液中还原型抗坏血酸氧化成为脱氢抗坏血酸，然后与,2,4,二硝基苯肼作用生成红色的脎。在,85,硫酸溶液的脱水作用下，可转变为桔红色的无水化合物,双,-2,4,二硝基苯。最大吸收波长,500nm,，吸光度与总抗坏血酸的总量成正比，进行定量分析。,文章,猕猴桃中维生素,C,的高效液相色谱分析,.pdf,二、脂溶性维生素类的分析测定,（一）理化性质,1,、溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。,2,、耐酸碱性：维生素,A,、,D,对酸不稳定，,VE,对酸稳定。,VA,、,D,对碱稳定，,VE,对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下也能经受碱的煮沸。,3,、耐热性、耐氧化性：,VA,、,D,、,E,耐热性好；,VA,、,E,易氧化，光、热能促进氧化；,VD,不易被氧化。,根据上述性质，测定脂溶性维生素时，通常先用皂化法处理样品，水洗去除类脂物。然后用有机溶剂提取脂溶性维生素（不皂化物），浓缩后溶于适当的溶剂中测定。为了防止氧化，常加入抗氧化剂。对于,A,、,D,、,E,共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。,操作在避光条件下进行。,（二）维生素,A,的测定,1,、比色法 国标第二法。维生素,A,在三氯甲烷中与三氯化锑作用，生成蓝色化合物，在波长,620nm,处有特异吸收。适用于维生素,A,含量较高的样品。该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定性差，比色测定必须在,6s,内完成，否则蓝色会迅速消退，造成极大误差。,2,、,高效液相色谱法,国标第一法。（,1,）原理：试样中的维生素,A,及维生素,E,经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱,C,18,反相柱将维生素,A,及维生素,E,分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。内标物：苯并,e,芘标准液 流动相：甲醇水（,98,2,）紫外检测器：波长,300nm,（,2,）样品处理：皂化：准确称样于皂化瓶中,加无水乙醇，搅匀,加抗坏血酸（抗氧化剂），加苯并,e,芘标准液（内标物）,加氢氧化钾（,1,1,）,于沸水浴回流,30min,，使皂化完全,立即放入冰水中冷却。提取：皂化物移入分液漏斗,加乙醚提取,弃去水层。洗涤：用水洗乙醚层，至水层不显碱性。浓缩：将乙醚提取液脱水（经无水硫酸钠过滤）后移入旋转蒸发器的球形蒸发瓶中,55,水浴中减压蒸馏,蒸发瓶中剩余,2mL,乙醚时，取下蒸发瓶，用氮气吹干,加乙醇溶解提取物,离心，上清液供色谱分析。,（三）维生素,E,的测定,1,、比色法 维生素,E,与,FeCl,3,反应，,Fe,3+,被还原成,Fe,2+,，,Fe,2+,可与,联氮苯发生颜色反应，呈红色，因此在,520nm,处测定吸光度，可定量测定样品中,V,E,的含量。,2,、,GC,法,3,、,HPLC,法,维生素,E,测定的,GC,分析条件化合物 检测器 固定相 检测波长 内标物,生育酚,FID SE30 275nm,十六烷基 棕榈酸酯,生育酚,FID DB5 300nm,胆甾烷胆固醇 （程序升温，,260 300,）,（四）,胡萝卜素的测定,1,、,高效液相色谱法,国标第一法。试样中的,胡萝卜素，用石油醚,-,丙酮（,80,20,）混合液提取，提取液于旋转蒸发器上蒸发至干，残渣用少量石油醚溶解，然后经三氧化二铝柱纯化，收集洗脱液，用,0.45,m,微孔滤膜过滤，滤液用,C,18,反相柱进行,HPLC,分析。流动相：甲醇乙腈（,90,10,）紫外检测器：波长,448nm,2,、纸层析法 国标第二法。试样经过皂化后，用石油醚提取食品中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于,450nm,波长下定量测定。,（五）维生素,D,的测定,1,、比色法维生素,D,与三氯化锑在氯仿中产生橙黄色物质，于,500nm,处定量测定。,2,、,HPLC,法样品经过抽出脂肪、碱性皂化、乙醚抽提不皂化物以及经过毛地黄皂苷,硅藻土和皂土二次柱层析，将脂肪、,V,A,和,V,E,等干扰物除去，然后注入液相色谱仪中，用含,0.7%,乙醇的异辛烷为流动相，以紫外检测器，波长,254nm,处进行测定，即可求出样品中,V,D,的含量。,（六）维生素,K,的测定维生素,K,易分解，因此提取样品中的,V,K,不采用皂化方法，而采用有机溶剂直接提取。一般植物样品经干燥后，将其置于有机溶剂如乙醚、丙酮、石油醚中剧烈振摇，把,V,K,抽提出来。动物组织样品也要预先干燥，再用有机溶剂抽提。,GC,法主要用于,V,K3,的测定。目前测定,V,K1,的常用方法为,HPLC,法。,高效液相色谱,法测定维生素,K1,维生素,K1,广泛存在于绿色蔬菜中。蔬菜中的维生素,K1,经石油醚提取后，注入经磷酸盐处理的氧化铝色谱柱中进行分离，除去干扰物。收集含,V,K1,的淋洗液流分，浓缩定容后注入高效液相色谱,C,18,柱，用紫外检测器测定。以外标法计算试样中,V,K1,的含量。流动相：甲醇正已烷（,98,2,）紫外检测器：波长,248nm,