实验四-血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,10 五月 2025,1,cellulose acetate membrane electrophoresis,实验四 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,10 五月 2025,2,【,实验目的,】,掌握电泳法分离血清蛋白质的原理,掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作方法及临床意义,10 五月 2025,3,电泳：,带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象,电泳技术,：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术,【,实验原理,】,10 五月 2025,4,H,OH,H,OH,pHpI pH=pI pH,纤维状分子,Q,越多，,u,越大；,分子小，,r,越小，,u,越大；,10 五月 2025,7,2.,缓冲溶液：,pH,值：,(pH-pI),越大，,Q,越多，,u,越大,离子强度,(I),：,I,越大，电动电势越小，,u,越小；,I,越小，电动电势越大，,u,越大，但样品易扩散。,离子强度如果过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持,pH,恒定,选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在,0.02,0.2,之间。,10 五月 2025,8,电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。,3.,电场强度,(X),X,越大，,u,越快。,支持物越短，,X,越大，,u,越快。,电场强度越大或支持物越短，,电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。,在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离,10 五月 2025,9,4.,支持介质：,纤维薄膜,(,玻璃纤维薄膜，醋酸纤维薄膜,),凝胶,(,琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶,),10 五月 2025,10,负极,正极,表面带负电荷,带正电荷的水层携带粒子向负极移动,如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快；,如果样品原本是,移向正极的，则泳动的速度减慢。,电渗作用,：,电渗：,在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。,以纸电泳为例,:,10 五月 2025,11,区带电泳的分类,（一）支持物物理性状,1,滤纸及其它纤维,(,如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤 维薄膜,),电泳,2,粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳；,3,凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳；,4,丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。,10 五月 2025,12,（二）支持物装置形式：,1,平板式电泳：支持物水平放置；,2,垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳；,3,垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳,10 五月 2025,13,(,三,)pH,连续性：,1,连续,pH,电泳：即整个电泳过程,pH,保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。,2,非连续,pH,电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的,pH,的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉，等电聚焦电泳等,10 五月 2025,14,醋酸纤维薄膜为支持物,pH=8.6,的巴比妥缓冲液,血清蛋白的,pI,均小于,8.6,负电荷,电泳时向正极移动,由于迁移率不同而被分离,10 五月 2025,15,2,1,清蛋白,分子越小，泳动速度越快,带电量越多，泳动速度越快,10 五月 2025,16,膜条经过氨基黑,10B,染色后显出清晰色带。,2.,定性,定量,各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。,可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。,用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。,10 五月 2025,17,醋酸纤维薄膜,：,醋酸纤维加工的细密且薄的微孔膜,广泛应用医学临床各种生物分子的分离分析,血清蛋白、血红蛋白、球蛋白,脂蛋白、糖蛋白,甲胎蛋白、类固醇及同工酶等,10 五月 2025,18,优点：,简单快速,缺点,分辨率较低（聚丙烯酰胺凝胶电泳，,PAGE,）,不适于制备（薄膜厚度约,10,100m,，样品用量很少）,10 五月 2025,19,【,器材及试剂,】,1,、器材：,醋酸纤维薄膜（,28cm,）,常压电泳仪,竹镊,点样器,人血清或鸡血清,粗滤纸,2,、试剂：,巴比妥缓冲液,氨基黑,10B0.25,染色液,漂洗液,透明液,10 五月 2025,20,操作,（一）仪器与薄膜的准备,1,、醋酸纤维素薄膜的润湿与选择,2.,电泳槽的准备,3,、电极槽的平衡,10 五月 2025,21,（二）点样,取出薄膜，无光泽面向上平放在滤纸上,点样区距阴极端,1.5 cm,血清均匀涂在点样器表面,将点样器轻轻印在点样区内，使血清完全渗透至薄膜内,形成一定宽度、粗细均匀的直线,实验的关键,，是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节,10 五月 2025,22,（三）电泳,点样端薄膜平贴,阴极,电泳槽支架滤纸桥,(,点样面朝下,),另一端平贴在,阳极,端支架,要求：,薄膜,紧贴,滤纸桥并,绷直,，薄膜之间相隔几毫米,盖电泳槽盖，平衡,10min,打开电源开关，调节电流强度为,0.3mA/,片，通电,10min,调节电流强度为,0.5mA/,片，电泳,60,90min,电泳后调节旋钮电流为,O,，关闭电泳仪切断电源,10 五月 2025,23,DYY-5,型稳压,稳流电泳仪,DYY-,型,电泳槽,10 五月 2025,24,10 五月 2025,25,10 五月 2025,26,【,实验注意事项,】,不要用手触摸纤维素膜,注意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛面,点样位置要在,1.5,厘米以内，不要距边缘太近,不要重复点样,膜放进电泳槽时，将点样面向下，点样端靠近阴极,10 五月 2025,27,用点样器点样时不要点的太多，但也不能太少,线条均匀，用力水平。,电泳槽放膜条支架上尽量不要有缓冲液,10 五月 2025,28,（四）染色和漂洗,取出薄膜，直接浸入染色液中，染色,5 min,自来水冲洗，漂洗液漂洗,更换,3,次漂洗液，脱去颜色，得到色带清晰的电泳图谱,10 五月 2025,29,【,实验结果,】,绘出电泳图谱并标明各条带含义,10 五月 2025,30,10 五月 2025,31,临床意义,血浆蛋白是血浆最主要的固体成分，含量,60,80g/L,绝大部分由肝脏合成，仅,球蛋白由浆细胞合成,正常值：,白蛋白,57,72,，,1,球蛋白,2,5,2,球蛋白,4,9,，,球蛋白,6.5,12,球蛋白,12,20,10 五月 2025,32,可能相关疾病,清蛋白,1,球蛋白,2,球蛋白,球蛋白,球蛋白,骨髓瘤,*,肾病综合症,*,*,肾炎,*,肝硬化,*,急性肝坏死,*,传染性肝炎,*,*,急性感染初期,*,*,*,慢性炎症,/,感染后期,*,低,球蛋白血症,*,临床上还可用,A/G,比来表示清球蛋白的量的关系：,正常人,A/G,1.5,2.5,10 五月 2025,33,血浆蛋白的主要功能,维持血浆胶体渗透压,调节血浆,pH,值，维持酸碱平衡,运输营养物质、代谢物、激素、药物及金属离子等,免疫作用,10 五月 2025,34,白蛋白降低：,合成能力不足,：肝功能下降,合成原料不足,：饥饿，腹泻，肿瘤晚期,去路增加：,肾病综合症，严重烧伤，大出血等,消耗过多：,糖尿病，甲亢等,10 五月 2025,35,球蛋白增加：,感染，多发性骨髓瘤，自身免疫性疾病等,球蛋白降低：,皮质功能亢进，免疫缺陷病,10 五月 2025,36,肝病：,A,2,-G,-G,1,-G,-G,，,A/G,下降甚至倒置,肾病：,早期：,选择性蛋白尿，,Mw,较小蛋白质丢失，含量下降。如白蛋白,后期：,非选择性蛋白尿，,Mw,较小的蛋白质丢失，含量下降,分子量较大的蛋白质（如,-,球蛋白）丢失，含量下降,10 五月 2025,37,【,实验思考,】,1,电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？,2,电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质？各谱带为何种,成分？请分析原因,10 五月 2025,38,【,常见问题及原因,】,1.,电泳图谱不齐：,点样时血清滴加不均,2.,电泳图谱出现条痕,：点样后薄膜过干，或电泳槽密闭性不,良，或电流过大，造成水分蒸发薄膜干燥,3.,分离不良：,标本滴加过多,4.,区带过于紧密：,缓冲液离子强度大于,0.075,10 五月 2025,39,5.,区带拖尾：,缓冲液离子强度小于,0.05,6.,染色后清蛋白中间色浅：,染色时间不足，或清蛋白量过高,减少样品用量或延长染色时间,