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高效液相色谱法研究白藜芦醇光致异构化动力学与平衡常数( 一)
原标题: 高效液相色谱法研究白藜芦醇光致异构化动力学与平衡常数
摘要: 反式白藜芦醇有多种生理活性, 自然资源丰富, 但存在光不稳定现象。 以光致异构平衡对照品溶液, 采用高效液相色谱谱建立了同时测定顺、 反异构体浓度的方法。 方法学考察显示符合含量测定要求, 反式异构体在 １.５ ～ ６０ μｍｏｌ ／ Ｌ、 顺式异构体在１.５～ ５５ μｍｏｌ ／ Ｌ 范围内线性关系良好, Ｒ ２ 均达 ０.９９９。 将该方法应用于研究光致异构化动 力学及平衡常数, 结果显示反式白藜芦醇在室温避光条件下中性、 偏酸性及乙醇介质中稳定; ２５ ℃时在 ５０％ ( ｖ ／ ｖ) 乙醇介质中的光异构平衡常数为 １１.７±０.３。 以光致异构平衡液制作标准曲线的策略简单方便, 具有可操作性; 反式白藜芦醇的稳定性与介质有关, 在 ｐＨ＜７ 的溶液中光致异构化为一级反应。
白藜芦醇( ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ, Ｃ１４Ｈ１２Ｏ３ , ５⁃( ４⁃ｈｙｄｒｏｘ⁃ ｙｓｔｙｒｙｌ) ｂｅｎｚｅｎｅ⁃１, ３⁃ｄｉｏｌ) 自然资源丰富, 至少在 ２１个科 ３１ 个属的 ７２ 种植物中发现, 如: 蓼科 Ｐｏｌｙｇｏ⁃ ｎａｃｅａｅ 植物虎杖 Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ Ｓｉｅｂ． ｅｔ Ｚｕｃｃ．的干燥根茎和根、 葡萄科植物葡萄Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ 果实的皮和籽、 豆科 Ｆａｂａｃｅａｅ 植物花生 Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ 的种子等。 白藜芦醇是一种生 物活性很强的天然多酚类化合物, 又称为芪三酚, 是 一种天然的抗氧化剂, 可降低血液黏稠度, 抑制血小 板凝结和血管舒张, 保持血液畅通, 预防癌症的发生 及发展, 具有抗动脉粥样硬化和防治冠心病、 缺血性 心脏病、 高血脂的作用。 植物中主要以反式异 构体存在, 有报道反式异构体在光、 热作用下可 转化为顺式异构体, 并有报道前者的生理活性强 于后者, 但迄今尚未见报道光致异构化动力学及在 不同介质溶液中稳定性的研究。 本文以光照后达到 平衡的反式异构体对照品溶液作为顺式异构体的对 照品溶液, 采用 ＨＰＬＣ 建立同时测定光照溶液中顺、 反式异构体含量的方法, 以测定室温避光和光照后 不同介质中顺、 反式异构体的含量, 研究稳定性及动 力学, 以期为白藜芦醇的应用与开发提供研究基础。
１ 实验部分
１．１ 仪器与试剂
Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ ＨＰＬＣ, 配 Ｗａｔｅｒｓ ２９９６ ＰＤＡ 检测器( 美国 Ｗａｔｅｒｓ 公司) 、 Ｅｍｐｏｗｅｒ 软件。
乙腈为色谱纯; 乙醇、 高氯酸、 浓盐酸、 无水枸橼酸、 磷酸氢二钠、 磷酸二氢钠、 无水碳酸钠、 碳酸氢钠 均为分析纯; 水为重蒸水。
称取适量反式白藜芦醇( 中国生物制品检定所, 含量＞９８.５％) , 用 ５０％ ( ｖ ／ ｖ) 乙醇溶液配制成 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的反式对照品储备液, 低温避光储存。
ｐＨ １.２ 溶液: 取含量为 ３６％ 的盐酸 ８.５ ｍＬ, 用 蒸馏水稀释至 １ ０００ ｍＬ, 调节 ｐＨ 至 １􀆰 ２; ｐＨ ４􀆰 ０ 缓冲溶液: 将 ０.１ ｍｏｌ ／ Ｌ 枸橼酸溶液 １２３ ｍＬ 与 ０.５ ｍｏｌ ／ Ｌ磷酸氢二钠溶液 ７７ ｍＬ 混合, 摇匀; ｐＨ ７.４ 缓冲溶液: 将 ０.０５ ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸氢二钠溶液 ８１ ｍＬ 与 ０.０５ ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸氢二钠溶液 １９ ｍＬ 混合, 摇匀。 ｐＨ９.０ 缓冲溶液: 将 ０.００２ ｍｏｌ ／ Ｌ 的无水碳酸钠 １０ ｍＬ 与 ０.００２ ｍｏｌ ／ Ｌ碳酸氢钠 ９０ ｍＬ 混匀, 调节 ｐＨ至 ９.０。
１．２ 溶液的准备
异构化实验溶液准备如下。 取反式对照品储备 液适量, 分别以 ｐＨ１.２ 水溶液、 １０％ ( ｖ ／ ｖ) 乙醇溶 液 ( ｐＨ４ ) 、 ５０％ ( ｖ ／ ｖ ) 乙醇溶液稀释至３０.０ μｍｏｌ ／ Ｌ, 置于无色普通透明玻璃瓶中, ２５ ℃ 室内自 然光下放置, 在 ０、 ０.２５、 ０.５、 １、 ２、 ３、 ４、 ５、 ６、 ７ ｈ 分别 取样以 ＨＰＬＣ 法进行测定。
避光稳定性实验溶液准备如下。 取反式对照品储备液适量, 分别以水溶液 ( ｐＨ １.２、 ７.４、 ９.０) 、 １０％ ( ｖ ／ ｖ) 乙醇溶液( ｐＨ４) 、 ５０％ ( ｖ ／ ｖ) 乙醇溶液 ( ｐＨ ７.４ ) 和 ５０％ ( ｖ ／ ｖ ) 乙醇溶液 稀释成 ３０.０ μｍｏｌ ／ Ｌ, 置于棕色玻璃瓶中, ２５ ℃ 避光放置, 在 ０、 １、 ６、 １２、 ２４、 ７２ ｈ 取样以 ＨＰＬＣ 法进行测定。
低温避光稳定性实验溶液准备如下。 取上述异 构化实验溶液准备中的 ５０％ ( ｖ ／ ｖ) 乙醇溶液稀释的 异构化溶液再继续在低温( ４ ℃) 下避光放置, 分别 在 １、 ３、 ５、 １０、 １５ ｄ 取样以 ＨＰＬＣ 法进行测定, 考察 顺、 反式溶液在低温下的稳定性。
１．３ 标准曲线溶液制备
反式异构体标准曲线溶液: 取反式对照品储备 液, 以 ５０％ ( ｖ ／ ｖ) 乙醇溶液制成 １.５０、 ３.００、 ６.００、 １５.００、 ３０.００、 ６０.００ μｍｏｌ ／ Ｌ 的溶液, 置于棕色玻璃 瓶中避光保存。
顺式异构体标准曲线溶液: 取上述反式异构体 标准曲线溶液适量, 置于无色普通透明玻璃瓶中, ２５ ℃室内自然光下放置 ５ ｈ, 取样以 ＨＰＬＣ 法进行测 定。 以初始反式异构体浓度减去相应平衡溶液中反 式异构体的浓度, 得到顺式异构体浓度依次为 １.５０、 ２.７７、 ５.５２、 １３.８５、 ２７.７０、 ５５.２２ μｍｏｌ ／ Ｌ。
１．４ 色谱条件
色谱柱 Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８ ( １５０ ｍｍ × ４.６ ｍｍ, ５ μｍ) ; 柱温 ３０ ℃; 流速 １.０ ｍＬ ／ ｍｉｎ, 进样体积 １０ μＬ。 流动相 ０.０５％ ( ｖ ／ ｖ) ＨＣｌＯ４ ⁃乙腈( ７３ ∶ ２７, ｖ ／ ｖ) , 检测波长 ２８５ ｎｍ( 顺式) 与３０４ ｎｍ( 反式) 。