新冠核酸单检检测标准操作规程.docx

新冠核酸单检样本检测标准操作规程
1. 检验目的
体外定性检新冠(2019-nCoV)ORF1ab和N基因，用于新冠感染的体检筛查。
2. 检测原理与方法
对新冠(2019-nCoV)ORF 1ab及编码核衣壳蛋白N基因的特异性保守序列为靶区域，进行了双靶标基因的设计，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量RT-PCR检测技术,通过荧光信号的变化实现样本RNA的检测。
PCR检测体系包含有内源性的内标引物和探针，通过检测内标是否正常来监测样本采集、提取过程，避免假阴性结果。
3. 职责
保证分子生物组实验室对于新冠(2019-nCoV)筛查检测结果的可靠性。
4. 性能特征
4.1准确性
检测企业阳性参考品，结果均为阳性。
4 2特异性
本试剂盒与冠状病毒(NL63,HKU1,229E,OC43)、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒Yamagata型、Victoria型、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、呼吸道合胞病毒A、B型、鼻病毒A、B、C型、腺病毒1、2、3、4、5、7、55型、副流感病毒1、2、3型、肠病毒A、B型、肠病毒C型(EV-C95)、肠病毒D型(EV-D70)、偏肺病毒、人间质肺病毒、新生隐球菌、化脓性性链球菌、鲍曼不动杆菌、肺孢子虫、肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎衣原体、EB病毒、人巨细胞病毒、烟曲霉、白色念球菌、光滑念珠菌、结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、诺如病毒、轮状病毒、水痘-带状疱疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人类基因组DNA等阳性样本无交叉反应。检测企业阴性参考品均为阴 性。
4 3精密度
批内精密度Ct值的变异系数(CV,%)W5%。
44最低检测限
本试剂盒最低检测限为200 copies/mL。
5. 标本类型及要求
5.1样本类型：咽拭子、肺泡灌洗液。
5.2样本采集：
5.2.1咽拭子：用1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含1.5m l病毒保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
5.2.2肺泡灌洗液：局部麻醉后将纤维支气管镜通过或鼻经过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支管，将其顶端契入支气管分支开，经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水，每次30〜50 ml，总量100〜250ml，不应超过300ml。
5.3样本灭活：将样本保存管置于金属浴56°C以上保持30分钟。
5.4样本保存和运送:待测样本可立即用于处理，能在24小时内检测的标本可置于4C保存；24小时内无法检测的标本则应置于-70C或以下保存（如无-70C保存条件,待测样本可于-20C保存10天，核酸样本-20±5C保存15天）。应避免反复冻融。样本运送采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。
6. 标本包装和运输
6.1标本采集后在生物安全二级实验室生物安全柜内分装。
6.2所有标本应放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的样本采集管里，拧紧。容器外注明样本编号、种类、姓名及 采样日期。
6.3将密闭后的标本放入大小合适的塑料袋内密封，每袋装一份标本。样本包装要求要符合《危险品航空安全运输技术细则》相应的标准。
6.4涉及外部标本运输的，应根据标本类型，按照A类感染性物质进行三层包装。
7. 试剂和仪器
7.1试剂：新冠2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）
7.1.1试剂来源：湖南圣湘生物科技有限公司
7.1.2试剂组份：
序号
试剂名称
规格与装量
主要成分
1
2019-nCoV-PCR -反应液
624uL/管
引物(4.62%)、探针(1.15%)、
dNTPs(3.85%)、MgCl2(0.77%)、
Rnasin(0.48%)、PCR buffer(89.13%)

2
2019-nCoV-PCR-酶混合液
96uL/管
RT 酶(62.5%)、Taq 酶(37.5%)
3
2019-nCoV-PCR-阳性对照
500 UL/管
含目标基因（ORF1ab、N基因）、内标基因
片段（Rnase P）的体外转录RNA
4
2019-nCoV-PCR-阴性对照
500 UL/管
生理盐水
7.1.3开启所有试剂需注明日期及签名。每个试剂盒都应贴有下列标签：物质名称、批号、特殊储藏说明、开盖人、开盖日期、开盖后有效期。开启时应检查试剂是否变色，是否有肉眼可见的细菌生长迹象、浊度、沉淀反应等，这些表示已经变质或超过保质期。
7.1.4试剂应避光密闭，试剂组分保存于-20±5°C。
7.1.5生产日期，失效日期请见外包装盒。不使用时，这些试剂在包装标识的效期内可稳定存放。一旦使用，扩增试剂盒反复冻融应不超过3次。
7.2仪器：适用于SLAN 96荧光PCR仪。
8. 环境和安全控制
8.1检测环境：PCR实验室条件达到生物安全二级及以上。
8.2安全控制：
8.2.1检验人员个人防护应达到生物安全三级，至少穿戴工作服、一次性工作帽、双层手套、医用一次性防护服、医用防护罩（N95及以上）或动力送风过滤式呼吸器、防护面屏或护目镜、工作鞋或胶靴、防水靴套。必要时，可加穿防水围裙或防水隔离衣。根据目前实验场地设置要求，个人防护设备在试剂配置区缓冲间进行穿戴齐全后再进入核心工作区。
8.2.2避免过度劳累，并及时对其健康情况进行监测，注意监测自身及身边检验人员体温和呼吸系统症状。
8.2.3防护装备脱卸的注意事项：脱卸时尽量少接触污染面。脱下的防护眼罩、长筒胶鞋等非一次性使用的物品应直接放入盛有消毒液的容器内浸泡；其余一次性使用的物品应放入黄色医疗废物收集袋中作为医疗废物集中处置。脱卸防护装备的每一步均应进行手消毒，所有防护装备全部脱完后再次洗手、手消毒。
8.2.4如果操作人员的皮肤或衣物上沾到了血液及废液，应立刻用清水冲洗并进行消毒处理。如果眼睛被溅入血液及废液，用大量的清水冲洗并采取必要的医疗措施。
8.2.5工作台在每天工作结束后用10%的次氯酸钠溶液清洗，空间用紫外线照射60分钟。
8.2.6此试剂为体外用，试剂含有防腐剂和稳定剂，存在一定的危险性；不要入，避免和眼睛，皮肤或衣服接触。
8.2.7医疗废物处理：本检测所产生的全部废弃物均应按《安全手册》中有关规定执行并遵循《医疗废物管理条例》和《医疗卫生机构医疗废物管理办法》的要求，规范使用双层黄色医疗废物收集袋封装后按照常规处置流程进行处置。
9. 操作步骤
9.1试剂准备（在试剂准备区进行）；
9.1.1取出盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温后,混匀后备用；
9.1.2根据待测样本数量，阳性对照和阴性对照数量，按比例（2019-nCoV-PCR反应液26应/人份+ 2019-nCoV-PCR-酶混合液4gL /人份）取相应量的组分，充分混匀成PCR混合液，瞬时离心后备用；
9.1.3将上述准备好的试剂转移至样本处理区，待用。
9.2样本处理（在样本处理区进行）
9.2.1新冠2019-Ncov 一步法提取核酸检测（单检）
9.2.1.1样本接收后打开外层包装箱，取出内物品，统一放恒温箱内56^放置30min以上（目前实验室常规使用温度：60-65^左右，放置30min）。灭活后取出，打开中层包装。样本在生物安全柜里进行再次震荡混匀，样本瞬时离心。每个PCR管中加入样本释放剂（型号S1014）10gL （建议深吸浅打，避免出现气泡）；
各管分别加入待测标本、阴性对照、阳性对照及弱阳性对照各10gL，吸打3-5次混匀轻轻吸打，避免出现气泡），室温静置10分钟以上；
9.2.1.3室温静置10分钟；
9.2.1.4将30gL配制好的PCR-混合液加入到装有20 u L上述处理后的样本PCR扩增管中,盖好八连管盖。
9.2.2新冠2019-Ncov磁珠法提取核酸检测（高风险人群）
使用S10015核酸提取或纯化试剂盒提取核酸
9.2.2. 1按照S10015-洗涤液2标签指示，使用前加入相应量的无水乙醇。
9.2.2.2根据样本数量，将蛋白酶K （20应/人份）和S10015-磁珠溶液（30应/人份）按照比例混合成蛋白酶K-磁珠混合液，震荡混匀，低速瞬时离心。
9.2.2.3根据待测样本数量取1.5m］离心管若干，每管加入300gL样品，每一次实验同时检测一份弱阳性对照、一份空白对照、三个阴性对照；
9.2.2. 4加入500|iL S10015-提取溶液1和50gL蛋白酶K-磁珠混合液；盖上管盖，震荡混匀30s,60°C 加热 10min.
9.2.2.5室温静置1min，低速瞬时离心，将离心管置于磁性分离器上，5min后吸弃废液（注意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠）；
9.2.2.6加入700|iL S10015-洗涤液1，震荡混匀30s，低速瞬时离心后将离心管再次置于磁性分离器。磁吸3min，将液体完全吸出丢弃（注意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠）；
9.2.2. 7加入700|iL S10015-洗涤液2,震荡混匀30s，低速瞬时离心后将离心管再次置于磁性分离器。磁吸3min，将液体完全吸出丢弃，继续于磁性分离器上静置2min，将液体完全吸尽。
注意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠；若此时洗涤液并非无色透明，需重复该步骤）；
9.2.2. 8室温开盖静置5min （乙醇残留会对后续实验造成不良影响，需保证乙醇充分挥发；同时不要干燥太长时间，以免磁珠挂壁难以洗脱）。
9.2.2.9加入60gL S10015-洗脱液S，震荡混匀30s,将离心管壁上磁珠洗脱到管底，室温静置5min ；低速瞬时离心将离心管再次置于磁性分离器上磁吸3min，然后将洗脱下来的核酸转移到干净的1.5m 1离心管中。
9.2.2. 10根据样本数量，取相应量的八连管，各管分别加入提取好的待测标本、阴性对照、阳性对照及弱阳性对照各20应，将30gL配制好的PCR-混合液加入到装有20gL核酸的PCR扩增管中，盖好八连管盖。
9.2.3将上述准备好的八连排转移至扩增区处理区，准备上机扩增。
9.3 PCR 扩增
9.3.1确定UPS工作状况正常后启动控制电脑，开SLAN 96P电源开关，打开电脑并双击桌面
“SLAN 8.2.2”图标，打开软件。
项目创建：首次操作需要进行项目创建，在软件最上方的项目栏点击项目创建，以后使用时就只需要调用相应项目程序就可以了。选择荧光检测通道选择：1）选择FAM（ORF-1ab区域）和ROX（N基因）通道检测2019-nCoV病毒核酸；2）选择HEX通道检测内标，设定循环参数完成创建实验项目。循环参数：
步骤
温度
时间
循环数
1
逆转录
50° C
30分钟
1
2
cDNA预变性
95° C
1分钟
1
3
变性
95° C
15秒
45
退火，延伸及荧光米集
60° C
30秒
4
仪器冷却
25° C
10秒
1
完成项目创建后，点击“HOME”进行基本设置，弹出的对话框中编辑所创建的项目名
称+样本号+日期，实验名称以及保存到相应的文件夹下，点击“孔板编辑”选择实验需要运行模块，选择项目程序，选择“实验分析”模块下点击开始运行扩增程序。
样本信息编辑将：将阳性对照、阴性对照及待测样本的点样顺序设置并设置样本名称和实验项目。
实验结果分析：反应结束后自动保存结果，对检测靶标以及内标的扩增曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3〜15、End值可设在5~ 20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线)，点击Analyze进行分析,使各项参数符合下述“10.质量控制”中的要求，然后到Plate窗下记录定性结果。
点击软件界面上方文件的下拉菜单打开可以直接打开上机文件，选择右侧分析类型，左上角的1〜6数字键可以选择对应的通道进行分析。
实验结果的导出：点击左上角的文件，在其下拉菜单中有导出，选择实验结果，可以导出*.xls格式的实验文件。
10. 质量控制
10.1 2019-nCoV-PCR-阴性对照:FAM、ROX 通道及内标(HEX)通道均无Ct值或Ct>40；
10.2 2019-nCoV-PCR -阳性对照:FAM、ROX 及内标(HEX)通道均 CtM35； 2019-nCoV-PCR -弱阳性对照:FAM、ROX及内标(HEX)通道均Ct<40；
10.3以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新进行。
11. 干扰和交叉反应
11.1标本检测结果与标本收集、处理、运送及保存质量有关，其中任何失误都将会导致结果不准确。如果标本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果。
11.2样本中可能存在的干扰物质：100pg/mL盐酸羟甲唑琳、50gg/mL地塞米松、50gg/mL盐酸头孢甲肟、100gg/mL奥司他韦、100pg/mL扎那米韦、100pg/mL利巴韦林、100pg/mL阿奇霉素、300U/mLa-干扰素、320pg/mL布地奈德、125gg/mL苯福林、100gg/mL妥布霉素、50gg/mL倍氯美松、100pg/mL氟尼缩松、100pg/mL莫米松、200pg/mL氟替卡松、200|ig/mL盐酸组胺、100pg/mL帕拉米韦、100pg/mL洛匹那韦、100哽/mL莫匹罗星、100哽/mL曲安奈德、100gg /mL利托那韦、100gg /mL阿比多尔、60gg /mL氯化钠、100gg /mL尿素、10gg /mL血红素、20gg /mL纯化粘蛋白、20%(v/v)无水乙醇、20%(v/v)人全血对试剂盒的检测结果无明显干扰。
12. 参考范围
本方法检测下限为200IU/ml，检测目标基因的Ct参考值为40；内标Ct的参考值为40。
13. 检验结果分析13.1对于FAM和ROX通道均检测到典型的S型扩增曲线，且Ct<40的样本，更换检验人员，使用两种不同厂家的新冠核酸检测试剂提取样本核酸进行复核，若结果ORFIab和N基因同时阳性时，判定为阳性；若仅ORFla或N基因其中之一检测结果阳性时，需重新采样复查,复查后ORPlab或N基因仍为阳性时,判定为阳性,并采用其他试剂成方法进行确认；报告为2019-nCoV病毒“初筛阳性待复查”，并将标本送至疾控确诊。
13.2对于FAM或ROX通道出现单靶标检测到典型的S型扩增曲线，且Ct<40的样本，使用不同厂家的新冠核酸检测试剂重新提取样本核酸进行复查，若仍为单靶标阳性，则重新采样进行复检；如果仍为单靶标阳性，报告为2019-nCoV病毒“初筛阳性待复查”，并将标本送至疾控确诊；否则判断为阴性。
13.3 Ct值位于灰区，当出现Ct值在37-40之间时为灰度区。可能存在下列情况:2个位点的检测结果均处于“灰度区”；1个位点判读为阳性，另1个立点的结果处于“灰度区” 1个位点判读为阴性，另1个位点的结果处于“灰度区”。出现以上情况时宜重新提取原标本的核酸，并与该标本前一次提取的核酸同时扩增检测。分析两次检验结果，单个位点两次阳性或两个位点为阳性，则报告“初筛阳性待复查”，两次结果均处于“灰度区”则报告“阴性”。
13.4对于FAM且ROX通道均未检测到典型的S型扩增曲线（No Ct），或两个检测位点无Ct值或CtN40,可报告“阴性”，并对结果进行解释。阴性结果不能完全排除2019-nCoV感染,此情况可能是病毒载量低于检出限,应结合临床分析。当临床表现及其他检查高度怀疑2019-nCoV感染时，建议重新采集标本或更换部位采集标本再次检测。
13.5对于FAM、ROX、HEX通道均未检测到典型的S型扩增曲线（No Ct），或Ct>40，表示本次检测样本细胞含量太低或者有干扰物质抑制反应，该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本重新采样，进行重复试验。
14. 临床意义
14.1及时发现和报告新冠感染的肺炎病例和阻断聚集性病例。
14.2握区域新冠感染疫情的特点，及时研判疫情发生发展趋势，及早干预。
15. 相关文件
15.1《新冠2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）》
15.2《新冠感染的肺炎实验室检测技术指南（第五版）》
15.3《新冠感染的肺炎诊疗方案（试行第八版）》
15.4《实时荧光PCR技术》
15.5《全国临床检验操作规程一第四版》
15.6《SLAN 96P标准操作规程》
15.7《医疗机构新冠核酸检测工作手册（试行第二版）》
17.相关记录
17.1《PCR定量项目工作流程记录表》
文件修订记录: