免疫组织化学技术(课堂PPT).ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,免疫组织化学技术,1,免疫组织化学,技术,基本原理,通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原,抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。,2,组织与细胞材料的制备,免疫组织化学方法,3,组织与细胞材料的制备,组织石蜡切片制作,组织冰冻切片制作,细胞爬片制作,细胞涂片制作,4,切片的制作,组织的固定,组织石蜡包埋,切片,5,目的,:,（,1,）,防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞,的固有形态。,（,2,）,使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶,性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的,死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。,（,3,）,使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造,成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。,（,4,）,固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制,片。,（,5,）,防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。,（,6,）,经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便,于辨认。,组织材料的固定,6,固定液的选择：,(1),甲醛固定液：,10,福尔马林，,10,中性福尔马林，,10,中,性缓冲福尔马林,(2)4,多聚甲醛固定液,(3)Bouin S,液及改良,Bouin S,液,(4)Zenker S,液,(5)Zamboni S,液,(6)PLP,固定液：过碘酸,-,赖氨酸,-,多聚甲醛固定液。该固定剂,较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保,存较好。,(7)PLPD,固定液 取,PLP,固定液,25ml,，加入,2.5%,重铬酸,25ml,。,(8)Kanovsky S,液,(9)Methacarn,固定液，对核内抗原的保存效果较好。,(10)PEG,液,(11)0.4%,对苯醌,(12),碳二亚酰胺,-,戊二醛（,ECG-G,）液,(13),丙酮及醇类固定剂,7,固定时间：,固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。,8,大组织：,75,乙醇,30,120min,，,85,乙醇,30,120min,，,95,醇,2h,，,95,乙醇,2h,，,95,乙醇,过夜，无水乙醇,30,60min,，无水乙醇,30,60min,，无水乙醇,60min,120min,，二甲苯,、,和,各,15min,（可视观察结果而定），石蜡,30min,石蜡,1,2h,，石蜡,2,3h,小组织：,75,乙醇,30min,，,85,乙醇,30min,，,95,乙醇,1h,、,1h,、,过夜或,2h,，无水乙醇,、,和,各,30min,，二甲苯,15min,、,10min,、,10min,（肉眼观察），石蜡,30min,，石蜡,30min,，石蜡,1,2h,。,组织石蜡包埋,9,切 片,载玻片的清洁：,市售载玻片需经清洁液泡,24h,，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片,240,烤,2h,。,切片粘合剂的使用：,（,1,）多聚赖氨酸（分子量,300KD,）：,0.5%,浓度。,（,2,）,APES,试剂（,3-,氨基、丙基三氧基硅烷）,干净载玻片丙酮,5min,用镊子夹住浸入,APES,试剂（,1ml+50ml,丙酮）,1,3,次纯丙酮洗二次干燥玻片用铝箔包好，室温或,4,保存备用。,（,3,）铬矾明胶液：铬矾,0.5g,明胶,5g H,2,O,2,1000ml,（,4,）甲醛明胶液：,40,甲醛,2.5ml,明胶,0.5g H,2,O,2,100ml,10,切片：,石蜡切片：,(1),连续切片按序贴在玻片的下,1/3,。,(2)52,60,烤片,18h,。,(3),切片厚,2,4,m,。,(4),切片刀要快,(5),编上号,(6),切片可在,4,保存数年,冰冻切片：,(1),冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理,24h,，冰冻切片。,(2),冰冻切片后需凉干后立即固定,(3),冰冻切片固定后,-80,保存备用,11,细胞爬片制作,将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。,待细胞生长达到,60,以上后取出玻片。,用,4%,的多聚甲醛固定,2h,以上。,可加甘油封存置于零下,20,度保存。,12,细胞涂片制作,离心将细胞收集出来，用预冷的,PBS,洗,2,3,遍，最后用,PBS,将细胞重悬。,吸取,30,50ul,（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。,待稍微风干以后加,4,多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定,2,4,小时。,在细胞上加一层甘油放,-20,保存。,13,免疫组织化学方法,荧光标记免疫组织化学,酶联免疫组织化学,14,荧光标记免疫组织化学,直接法 间接法,15,酶联免疫组织化学,ABC,法,S-P,法,16,免疫组化二步法,17,二步法,免疫,组化染色步骤,二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯,PBS,冲洗3次，每次3分钟,根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复,0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS,冲洗、浸泡5分钟，3次,正常山羊血清室温封闭10分钟,18,甩去血清，加入适当稀释的一抗，37孵育60分钟或4过夜,PBS,冲洗，浸泡5分钟，3次,滴加多聚螯合物，37孵育30分钟,PBS,冲洗，浸泡5分钟，3次,新鲜配置酶底物显色液,DAB,显色310分钟,流水冲洗,苏木素复染，脱水，透明，封片。,显微镜观察拍照,IPP,软件分析光密度,19,抗原修复方法,真空负压抗原修复法：,切片脱蜡至水。,0.3%H2O2,甲醇真空负压处理,5,分钟。,自来水洗，蒸馏水洗。,0.01M,柠檬酸盐缓冲液（,PH6.0,），真空负压干燥箱预先调至,95,，真空负压处理,10,分钟。,待修复注降至室温的一，,PBS,洗,3,次，随后按选好的免疫组化染色方法进行染色。,20,微波辐射抗原修复法：,切片脱蜡至水。,0.3%H2O2,甲醇处理,10,分钟。,自来水洗，蒸馏水洗。,0.01M,柠檬酸盐缓冲液（,PH6.0,），于微波炉内微波辐射,10分钟，如检测,Er,和,Pr,则需要,20,辐射分钟左右。,待修复液降至室温后，,PBS,洗,3,次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。,21,高压抗原修复法：,切片脱蜡至水。,0.3%H2O2,甲醇处理切片,10,分钟。,自来水洗，蒸馏水洗。,切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续,1,4,分钟。,待修复液恢复至室温后，,PBS,洗,3,次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。,22,隔水热抗原修复法：,切片脱蜡至水。,0.3%H2O2,甲醇处理切片,10,分钟。,自来水洗，蒸馏水洗。,切片放入,0.01M,柠檬酸盐缓冲液（,PH0.6中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（,92,）。即开始计时，持续,40,分钟。,待抗原修复液恢复至室温后，,PBS,洗,3,次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。,23,电炉加热抗原修复法：,切片脱蜡至水。,0.3%H2O2,甲醇处理切片,10,分钟。,自来水洗，蒸馏水洗。,将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达,92,后，即可拔离电源，当温度低于,92,时，再插上电源，如此反复持续至,10,分钟左右。,待抗原修复液降至室温后，,PBS,洗,3,次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。,24,胃蛋白酶消化法：,切片脱蜡至水。,0.3%H2O2,甲醇处理切片,10,分钟。,自来水洗，蒸馏水洗。,PBS,洗,3,次，,1,分钟,/,次。,滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片,20,分钟左右。,PBS,冲洗,3,次，,2,分钟,/,次。,后按选择好的免疫组化该法进行染色。,25,胰蛋白酶消化法：,切片脱蜡至水。,0.3%H2O2,甲醇处理切片,10,分钟。,自来水洗，蒸馏水洗。,PBS,洗,3,次，,1,分钟,/,次。,滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片,20,分钟左右。,PBS,洗,3,次，,2,分钟,/,次。,后按选好的免疫组化染色方法进行染色。,26,注意事项,一、抗体的保存,浓缩抗体：有效期内，只需放在,4 冰箱内，保存时间可达,1-3,年。,即用型抗体：理论上在4 冰箱内,可保存半年左右。,PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般,只可放置1-,2,个月。,27,二、出现假阳性的原因,组织切片质量不佳，造成假象，如,刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作,为判断阳性的依据。,出血和坏死：红细胞的内源性过氧,化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化,物酶均可出现假阳性反应。,抗体的交叉反应。,28,三、出现假阴性的原因,固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。,固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用10%中性福尔马林。,抗体浓度过低。,孵育时间太短，或孵育温度太低。,缓冲液pH值不正确。,29,30,四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。,五、DAB有致癌性，用后不应随处倒弃。,31,Thank You!,32,