细胞培养技术.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞培养技术,1,细胞培养也叫细胞克隆技术。,通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以细胞培养技术是生物技术中,最核心、最基础的技术。,什么是细胞培养？,2,主要内容,实验设备,试剂及耗材,清洗及灭菌,细胞培养,（细胞生长过程，细胞来源，细胞复苏、传代及冻存，细胞计数，活力测定，细胞污染）,3,一实验设备,超净工作台，生物安全柜,CO,2,培养箱,倒置显微镜,离心机,电热恒温水槽,液氮罐,纯水仪,压力蒸汽消毒器,电热干燥箱,4,超净台 生物安全柜,酒精灯（,），,离开要熄灭！,酒精灯（,）,5,CO,2,培养箱,CO,2,培养箱设定的条件为,37,，,5,CO,2,。,倒置显微镜,6,离心机,电热恒温水槽,液氮：,-196,液氮罐,配平,7,纯水仪 压力蒸汽灭菌器 电热干燥箱,由工作人员操作，注意安全！,8,小结一实验设备及功能,超净工作台，生物安全柜,-,操作平台,CO,2,培养箱,-,细胞生长的空间,倒置显微镜,-,观察细胞,离心机,-,离心收集细胞,电热恒温水槽,-,加热,液氮罐,-,冻存细胞,纯水仪,-,制备一级水,压力蒸汽消毒器,-,灭菌,电热干燥箱,-,烘干器皿,（酒精灯安全）,9,二试剂及耗材,培养基,缓冲液,消化液,血清,其他,耗材,10,培养基,供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境,。,成分及作用：,氨基酸：,组成蛋白质的基本单位,碳水化合物：,能量来源,无机盐：,帮助细胞维持渗透压平衡,维生素：,维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用,11,培养基分类,DMEM,（,高糖,，葡萄糖,4500 mg/L,）：成纤维、上皮细胞（,293,），一些实体瘤（Panc-1,），原代神经元,DMEM,（,低糖,，葡萄糖,1000 mg/L,）：间充质干细胞，单抗细胞融合,RPMI 1640,：血液细胞（,HL60,）、一些实体瘤细胞（,BT474,）,酚红：,PH,指示剂（黄色过酸、紫色过碱）；,酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素），涉及到激素和诱导的实验，建议选用无酚红培养基。,ATCC,https:/www.atcc.org/,美国模式培养物集存库,12,缓冲液（洗涤细胞）,PBS,：,磷酸缓冲盐溶液,具有,pH,缓冲作用的等渗盐溶液（常规实验皆可用）。（,Na2HPO4,、,KH2PO4,、,NaCl,和,KCl,）,D-PBS,：,杜氏磷酸缓冲液,，,磷酸盐含量稍低,，,含有钙镁离子,，,用于胚胎学方面的研究,。,Hanks,：,平衡盐溶液,无机盐和葡萄糖浓度接近大部分动植物细胞的水平，可作为动植物细胞短期培养,(,几个小时,),。,D-Hanks,：,不含钙离子、镁离子、葡萄糖（使用消化液时）。,13,消化液,胰蛋白酶溶液,使细胞间蛋白质水解、细胞离散。使用浓度,0.25%,。,配制时要用,不含Ca2+、Mg2+及血清,（,对胰酶产生抑制作 用）,的平衡盐溶液（如,PBS,、,D-Hanks,）。,EDTA,溶液,一般用其钠盐，可溶性较好。有些组织需要,Ca2+、Mg2+,来保持其完整性，,EDTA可以螯合这些离子,，可使细胞之间裂解。其作用比胰蛋白酶缓和。使用浓度为,0.02%,，以,无钙、镁的平衡盐溶液配制,。,胶原酶溶液,主要,水解结缔组织中胶原蛋白,成分（用胰蛋白酶效果较差），使用,Hanks,溶液配置，常用剂量为最终浓度,200U/ml,（约为,1mg/mL,）。,14,提供基本营养物质、激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞的起到某些保护作用。,保存血清最好的方法？,建议血清,保存在,-20,。解冻后存放于,4,时，请勿超过一个月。（,分装,）,如何解冻血清才不会使产品质量受损,?,建议从冷冻箱取出后，置于,2,8,冰箱使之,缓慢解冻、融解,使用时，必须将解冻的血清,充分混匀,，并且勿将血清置于,37,太久。,血清,15,青霉素,-,链霉素溶液,青霉素的工作浓度为,100 U/ml,，,链霉素的工作浓度为,0.1 mg/ml,。,分别阻止细菌细胞壁合成及细菌蛋白质的组成，达到,抑制细菌生长的作用,，防止污染，,对真菌和支原体无效,。,其他实验所需的试剂,：,药物（如,ATRA,）、检测试剂（如,MTT,）、细胞因子（如,SCF,）等,16,试剂标注规范,试剂名称,NaCl,配制浓度,0.5 mM,配制人 张三,配制日期,2016.10.21,17,耗材,培养皿、瓶、孔板,离心管、移液管,枪尖,其他,18,小结二试剂及耗材的分类及用途,培养基（成分、分类）,缓冲液（,PBS,、,Hanks,等）,消化液（分类及应用）,血清（作用、存储及解冻方法）,试剂标签要规范,耗材（分类、用途）,19,在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长,微生物产品附带杂物,上次细胞残留物,非营养成分的化学物质,需要清洗的培养用品,:,玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品,。,（包括：,浸泡（洁消精）、超声波清洗、冲洗、烘干,四个步骤）,三清洗及灭菌,20,消毒灭菌方法,物理消毒灭菌法,Co60,辐射（,射线）,：破坏生物大分子（塑料制品）,紫外线（,200-300 nm,）,：,30min,，阻止,细菌、病毒核酸合成。（,细胞室：,用于空气，操作台表面等,）,湿热（高压蒸气灭菌法）,：,121,，,20min,，破坏微生物孢子、蛋白变性。（,用于大量液体、玻璃器皿、部分塑料耗材、手术器械等，由工作人员操作）,干热：,160,2,小时，高热作用下的氧化作用破坏微生物（耐高温的玻璃和金属制品）,过滤：,0.22,m,滤膜过滤除菌（少量试剂）,21,消毒灭菌方法,化学消毒灭菌法,75%,酒精,主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理（,蛋白凝固,）（,不能擦拭有机玻璃,）,1,新洁尔灭,主要用于器械的浸泡，皮肤和操作室壁面的擦试消毒（,阳离子表面活性剂,，能破坏细胞膜，改变其通透性而起杀菌作用）22,需要清洗的物品：玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。,清洗的步骤,灭菌的方法：,-,紫外线（超净台、生物安全柜）,-,高压蒸汽灭菌（准备好放在准备室,502,）,-75%,酒精（表面消毒，小心酒精灯明火）,小结三清洗及灭菌,23,四细胞培养,生长类型,细胞来源,细胞复苏,细胞传代,细胞冻存,细胞计数,活力测定,污染种类,24,细胞的生长类型,粘附型,细胞,：附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。（绝大多数正常细胞及实体瘤细胞）,悬浮型,细胞,：不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。（主要是白血病细胞等）,小鼠单核巨噬细胞,白血病细胞,25,细胞贴壁过程,26,每代贴壁细胞的生长过程,游离期,（接种后在培养液中呈悬浮状态，细胞质回缩，细胞体圆球形）,贴壁期,（细胞平均在,10,分钟,4,小时贴壁,，底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等）,潜伏期,（有生长活动，而无细胞分裂，一般为,6,24,小时,对数生长期,（细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳。,最适合进行实验研究,）,停止期（平台期）（,细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性）,（悬浮细胞没有贴壁过程）,27,国内可以买到细胞株的地方有哪些？,ATCC,（美国模式培养物集存库）国内代理,ECACC,（欧洲细胞株、微生物保藏中心）国内代理、,sigma,中国科学院细胞研究所,中国医学科学院（协和医科大学）基础医学部,武汉大学冷藏中心等,细胞来源,28,确定细胞株的培养信息（,ATCC,）,配制培养基（基础培养基,+10%,胎牛血清,+,双抗）、胰酶、,PBS,无菌培养瓶、吸管、离心管的准备,准备工作,29,细胞复苏（快融）,（,l,）从液氮中取出冷冻管，,迅速投入,37,水浴中，使其融化（,1,分钟左右）。并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。,（,2,）用培养液稀释后低速离心,10,分钟。,（,3,）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,（,4,）隔天换液，但贴壁细胞若未贴壁则勿需处理。,复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而损伤细胞。,30,细胞传代,细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。,传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。,31,细胞传代,1,悬浮细胞传代,离心法传代,：离心（,1000,转,/,分,）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。,直接传代法,：悬浮细胞沉淀在瓶底时，将上清培养液去除,l,2,一,2,3,，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。,2,半贴壁细胞传代,（,Hela,细胞）,此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。,离心 新鲜培养基悬浮 铺板,32,细胞传代,3,贴壁细胞传代,采用酶消化法传代。常用的,0.25,的胰酶。,吸掉上清，加入,PBS,缓冲液洗涤，弃掉洗液，加入适量胰酶消化液，,37,消化,1,分钟左右，加入含血清的培养基终止消化，并离心去上清，重新稀释后接种。,注意：,开放式操作，小心谨慎、谨防污染！,33,细胞冻存（慢冻）,1,细胞冻存液（,1ml/,管）,基础培养基,70,胎牛血清,20,DMSO 10,（二甲基亚砜，一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶对细胞的损伤。）,2,细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？,冷冻管内细胞数目一般为,1-8x10,6,cells/ml,缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。,34,细胞冻存,3,慢冻程序,传统方法：,4 10,分钟,-20 30,分钟,-80 16,18,小时（或过夜）液氮长期保存。,程序降温盒：利用异丙醇实现梯度降温（易挥发，并且易吸收空气中的水分，冷冻过程中可以辅助实现缓慢降温，每十分钟降一度）。,35,细胞冻存,36,小结四 细胞培养过程,细胞生长类型及传代方法,细胞,培养过程,注意,无菌操作,（全程）,准备工作,复苏（快）,传代（无菌）,冻存（慢）,实验,细胞信息、方法 冻存液成分、,培养基、耗材 程序,37,细胞计数,血细胞计数器：手工计数细胞,38,细胞计数,计算公式：细胞数,/ml,4,大格细胞总数,/4,稀释倍数,10,4,39,细胞计数,注意事项,记上,不记下，,记左,不记右。,吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下,不要有气泡,。,镜下偶见由两个以上细胞组成的,细胞团,，应按单个细胞计算，若细胞团占,10%,以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,40,培养细胞活力测定,细胞活力测定是体外实验研究中应用最广的技术手段之一。,任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从,形态上区别,死、活细胞是,困难,的。,41,培养细胞活力测定,1,细胞克隆形成率实验,单个细胞在体外增殖,6,代以上,，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力。,克隆形成率（克隆形成数接种细胞数）,100%,优点：精确、可靠，适于贴壁细胞,42,培养细胞活力测定,2,台盼蓝法（,0.4%,）,细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故,活细胞不被染色，死细胞染成蓝色,。,用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活性。,43,培养细胞活力测定,3,四唑盐（,MTT,）比色法,四唑盐（,MTT,）商品名为噻唑蓝。,原理：,活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（,formazan),并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（,DMSO,）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的,formazan,量成正比。再用酶标仪测定,OD,值。,MTT,法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。,44,细胞培养的污染类型,细菌污染,真菌污染,支原体污染,病毒污染,非同种细胞污染,化学污染,45,细菌污染,小鼠胃癌细胞的球菌感染,46,念珠菌污染,真菌污染,丝状菌污染,47,真菌污染,典型的霉菌污染，肉眼看到白色的团块或白点，镜下呈丝状。,400,倍图片,48,支原体污染,支原体污染电镜照片,(X30k),，煎蛋状和其他形状,49,细菌和真菌污染多发生在传代、换液、加样等,开放性操作,之后。,原代操作,尤其注意！因此，细胞培养切记：,“,无菌”理念贯穿始终,，包括：器皿、器械、耗材、培养基、试剂、操作习惯。（,一旦污染、立即弃用！,）,如何避免污染？,细节决定成败！,50,小结五 实验方法,细胞计数的方法,细胞活力测定的方法分类、原理及应用,注意防止细胞污染,51,总结,细胞实验所需设备的类型及功能,试剂及耗材的分类及各自用途,清洗物品的过程及灭菌的方法,细胞培养,细胞生长过程，细胞来源,细胞培养过程（复苏、传代及冻存）,细胞计数及活力测定方法,注意无菌操作，防止细胞污染,52,实验中心细胞培养室规章制度,细胞实验室是进行各种细胞培养的净化实验室，研究人员经申请准入、,培训合格后方可进入细胞室,；所有人员必须遵守实验室规章制度，接受工作人员的管理。,进入细胞室前必须,穿工作服、换鞋,，非实验物品不得带入室内。,严禁,带入,易燃、易爆及其他有毒、有害或有刺激气味的物品,。注意,消防安全,，杜绝一切可能导致火灾的行为。,不得,在细胞室内进行病原性微生物等,易传染物的操作,；进行,病毒感染,细胞的操作须报管理人员,备案,，在指,定的生物安全柜内（,8,室）,进行，使用一次性耗材，并遵守生物安全操作规范。,实验室,公用物品在使用后必须放回原处,，不得外借或带到其它实验室；不得擅自更改仪器程序；仪器发生异常时，应立即向管理人员报告。若因不按操作规程使用造成仪器损坏，使用者应酌情赔偿。,配制试剂,应数量适当，,标注规范,，按规定妥善存放。无菌试剂,专人专用,，防止交叉污染。未经允许，不得使用他人物品及翻看他人细胞。,若发现,细胞被污染，应立即弃用,，禁止继续培养和冻存。进入细胞实验室的所有新细胞株，由管理人员建立细胞株库。其他细胞的冻存，由实验者标记明确后存入指定位置。,实验结束后，应及时清理,桌面和地面，整理实验器材。观察培养箱，待温度及,CO2,浓度正常后方可离开。废弃物品应及时带出操作间，进行相应处理。,遵守,生物垃圾、利器和生活垃圾分类存放,规定，禁止向水槽内倒入杂物、腐蚀性液体和有毒试剂等。,53,THANKS!,54,