新冠病毒采集和检测技术指南.docx

附件10
新冠病毒样本采集和检测技术指南
为指导各级疾控部门和其他相关机构规范开展新冠肺 炎病例标本采集与实验室检测工作，保证检测质量，提高检 效率，特制定本指南。
一、标本采集
（一）采集对象。
新冠肺炎病例、可疑感染人员和其他需要进行检测的/员， 以及可能被污染的环境或物品等。
（二）采样人员基本要求。
从事标本采集的技术人员应当经过生物安全、监测技培 训并合格，熟悉标本采集方法，熟练掌握标本采集操作程。 应严格按照操作流程进行采样，按要求做好标本信息录，确 保标本质量符合要求、标本及相关信息可追溯。
（三）标本采集基本要求。
1. 住院病例的标本由所在医院的医护人员采集密切接触 者标本由当地指定的疾控机构、医疗机构负责采集。采标本 时，要根据不同采集对象设置不同的采样区域，发热者前往 发热门诊就诊、采样，未设置发热门诊的机构应设发热患者 专用采样区域，将发热患者与其他检测人群分区采
样，避免交叉感染。
2. 无症状感染者、入境人员、密切接触者在隔离观察间 应采集鼻咽拭子进行核酸检测，解除隔离时应同时采集2份 鼻咽拭子样本，分别使用不同核酸检测试剂检测2 次检测 原则上由不同检测机构开展。
3. 根据临床及实验室检测工作的需要，可在住院、隔|
间多次采样，可同时采集呼吸道、血液、便等多种标本采样 人员应严格遵循采样规范采集标本，保障所采集标本量符合 要求，同时应详细记录受检者信息，可利用条形码描等信息 化手段采集相关信息。
4. 人群筛查应根据核酸提取检测所用试剂的要求确定采 样管，可选择含病毒灭活剂胍盐或表面活性剂等的采样管。 用于病毒分离的标本应放置于不含有病毒灭活剂的样管。
5. 物品和环境监测应根据监测目的和防控需求确定采样 物品、位置与数量，采样时应严格遵循采样规范。
（四）采集标本种类。
每个病例必须采集急性期呼吸道标本包括上呼吸道标本 或下呼吸道标本,）重症病例优先采集下呼吸道标本；根据临 床需要可留取便标本、全血标本、血清标本和尿标本物品和 环境标本根据监测需求采集。
标本种类：
1. 上呼吸道标本：包括鼻咽拭子、咽拭子等。
2. 下呼吸道标本:深咳痰液、肺泡灌洗液、支气管灌洗液、 呼吸道吸取物等。
3. 便
标4.血液标本：抗凝血，采集量ml，建议使用含有DTA抗 凝剂的真空血管采集血液。
/5.血清标本：尽量采集急性期、恢复期双份血清。第粉
肛清应当尽早（最好在发病后天内）采集，第二份血清应当 在发病后第3〜4周采集。采集墨ml,建议使用无抗凝剂的真 子采血管。血清标本主要用于抗体的测定，不进行酸检测。
:6.尿标本：留取中段晨尿，采集量2〜3ml。
留7.物体表面标本:包括进冷链食品或进货物的内外包 装表面，以及运输储藏工具等可能被污染的部位进行涂采集 的标本。
便8.污水标本:根据海运岸大型进冷冻物品加工处理场 标排水系统分布情况，重点选取污水排水内部管网汇集处、 污水流向的下游或与市政管网的连接处第3处点位进行采 样。
1（四）标本采集和处理。
01.鼻咽拭子：采样人员一手轻扶被采集人员的头部，一手
执拭子，拭子贴鼻孔进入沿下鼻道的底部向后缓缓深入，由于鼻道 呈弧形，不可用力过猛，以免发生外伤出血。待拭 花
生 ,如果不便于留取便标本，可采集肛拭子。 子顶端到达鼻咽腔后壁时，轻轻旋转一周（如遇反射性咳嗽应停 留片刻,）然后缓缓取出拭子，将拭子头浸入含2〜3ml病毒保 存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液） 的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
2.咽拭子：被采集人员先用生理盐水漱，采样人员将 拭 子 放 入 无 菌
生3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物用与负压泵相连的收集器 从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器部 插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退，收 集抽取的粘液，并用ml采样液冲洗收集器次（亦可用小儿导 尿管接在50ml注射器上来替代收集器）
湿4.深咳痰液：要求病人深咳后，将咳出的痰液收集于含 遍l采样液的采样管中。如果痰液未收集于采样液中，可在检 测前，加入2〜3ml采样液，或加入痰液等体积的痰液消4液。 痰液消化液储存液配方见表1。
止 将 拭 子
表1痰液消化液储存液配方
成分质量/体积
二硫苏糖醇0.1g
氯化钠0.78g
氯化磷0.02g
磷酸氢二钠0.112g
磷酸二氢钾0.02g
水7.5ml
PH值 7.4±0.2 (25°C)
使用时将储存液用去离子水稀释J50ml,与痰液等体积混 合使用，或者参照试剂说明进行使用，也可采用痰液等积的 含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液将痰液化。
5.支
气
管
灌6.肺泡灌洗液:局部麻醉后将纤维支气管镜通过或J经 过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支气管，将其顶端契入气 管分支开，经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水，次30〜 50ml，总量1〜250ml,不应超过3ml。
将7.粪便标本：取1ml标本处理液，挑取黄豆粒大小的便标 本加至管中，轻轻吹吸〜5次，室温静置0分钟，以80 集
rpm离心5分钟，吸取上清液进行检测。粪便标本处理液可行 配制，配方见表2。
表2粪便标本处理液配方
成分质量/体积
Tris1.211g
氯化钠8.5g
无水氯化钙（或含结晶水的氯化钙）1.1g（1.47g）水
8ml
用浓盐酸调节pH为7.5，以去离子水补充至10 ml
也可使用HANK’S液或其它等渗盐溶液、组织培养液麟 酸盐缓冲液溶解便标本制备便悬液如患者出现腹泻症状, 则留取粪便标本〜5ml,轻轻吹打混匀后，以0rpm离心5 分钟，吸取上清液备用。
8. 肛拭子：用消毒棉拭子轻轻插入肛闵〜5cm,再轻轻旋 转拔出，立即放入含有〜5ml病毒保存液的!5ml外螺旋盖采样 管中，弃去尾部，旋紧管盖。
9. 血液标本:建议使用含有?DTA^凝剂的真空采血管采集 血液标本5ml,根据所选用核酸提取试剂的类型确定以全血或 血浆进行核酸提取。如需分离血浆, 将全血15〜 20rpm离心10分钟，收集上清液于无菌螺塑料管中。
10. 血清标本：用真空负压采血管采集血液标本】，室温 静置30分钟，15〜20rpn离心10分钟，收集血清于无菌螺 塑料管中。
11. 物体表面标本：参考《农贸（集贸）市场新型冠』病 毒环境监测技术规范》WS/T776—2021 ）推荐的方法，采样拭 子充分浸润病毒保存液后在表面重复涂抹，将拭子放采样管 浸润，取出后再次涂抹采样，重皴以上。对表面 较大的物 体进行多点分布式采样。
12. 污水标本：参考《农贸（集贸）市场新型冠状病箫 境监测技术规范》（WS/T776 — 2021）推荐的方法，采集污水的 拭子样本时，用拭子浸入吸附污水，将拭子放回采样浸润， 取出后再次浸入污水，重复3次以上，对每个污水采 样位置应 进行多点分布式采样采集污水的水体样本时用聚乙烯塑料 瓶收集1L〜1.5L污水，大于1.5L体积的污水采集，可以使用 聚乙烯塑料桶或现场水样专用富集设1污水水体样本采集前， 先充分混合均匀后取样；如果污水难以稔混合，出现分层现 象时，可按各层水量的比例分层取样。
13 .其他材料：依据设计需求规范采集。
（五）标本包装。
标本采集后在生物安全二级实验室生物安全柜内分装1.
所有标本应当放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐 冷冻的样本采集管里，拧紧。容器外注明样本编号、种类姓 名及采样日期。
2.将密闭后的标本装入密封袋，每袋限一份标本。样包 装要求要符合《危险品航空安全运输技术细则》相应的准。
3.涉及外部标本运输的，应根据标本类型,按照或B类 感染性物质进行三层包装。
（六）标本保存。
用于病毒分离和核酸检测的标本应当尽快进行检测，在 24小时内检测的标本可置于4C保存24小时内无法检测 的标 本 则
应（七）标本送检。
置 标本采集后应当尽快送往实验室，标本采集后室温
（25C ）放置不宜超过小时。如果需要长途运输，建议采用 干冰等制冷方式进行保藏。标本运送期间应当避免反复融。
71.上送标本。
0 各省（自治区、直辖市）发现的本土疫情中的首发或早 期病例、与早期病例有流行病学关联的关键病例、感染来源 不明的本土病例、境外输入病例、入境物品及相关环境阳性 标本等所有原始标本应平行采集至少2份，一份送各省级疾控 机构进行检测，另一份上送中国疾控中心进行检测、复核同时附 样本送检单（见附件10-1。各省分离到的新的代表性毒株， 存及时送中国疾控中心复核、保藏。
（2.标本及毒株运输。
如 （1）国内运输。
无
新冠病毒毒株或其它潜在感染性生物材料的运输包装 分类属于A类，对应的联合国编号为N2814,包装符合国际民 航组织文件Doc9284《危险品航空安全运输技术细则》PI620 分类包装要求;环境样本属于B类，对应的联合国编号为UN3373 包装符合国际民航组织文件oc9284《危险品航 空安全运输技 术细则》的？I650分类包装要求；通过其他交通工具运输的 可参照以上标准包装。
新冠病毒毒株或其它潜在感染性材料运输应按照《可染 人类的高致病性病原微生物菌毒)种或样本运输管理规定(原 卫生部令第45号)办理《准运证书》。
(2) 国际运输。
在国际间运输的新冠病毒标本或毒株，应当规范包装按 照《出入境特殊物品卫生检疫管理规定》办理相关手续并满 足相关国家和国际相关要求。
(3) 标本和毒株的接收及管理。
通过航空进行运送的标本抵达目的地机场后，由专业输 车辆运送至接收单位，通过陆路运输的标本由专业车辆进运 送，运送人员和接收人员应对标本进行双签收。
新冠病毒标本及毒株应由专人管理，准确记录标本及株 的来源、种类、数量，编号登记，采取有效措施确保毒株样 本的安全，严防发生误用、恶意使用、被盗、被抢、失、泄 露等事件。
二、新冠病毒的实验室检测
（一）检测人员要求。
实验室检测技术人员应当具备实验室工作经历以及相 关专业技术技能，接受过新冠病毒相关检验检测技能培训检 测机构应当按照所开展检测项目及标本量配备实验室测 人员，以保证及时、高效完成检测和结果报告。
（二）实验室检测。
1.实时荧光RT-PCR方法检测新冠病毒核酸。
（1）核酸检测实验室。新冠核酸检测实验室按功能区布 置位置的不同，可分为集中布置形式和分散布置形式。开展 新冠病毒核酸检测的实验室应当设置以下区域：试剂储存和 准备区、标本制备区、扩增和产物分析区。根据所采用仪器的 实际情况，标本制备区、扩增和产物分析区可进行合并集中布置形 式的实验室设置应遵循 咯区独立，单向流动（注意风向，压力梯 度走向，）因地制宜，方便工作”的原则。各区的功能如下：
试剂储存和准备区：用于分装、储存试剂、制备扩反 应混合液，以及储存和准备实验耗材该区应配备冰箱或冰柜、 离心机、试验台、涡旋振荡器、微量加样器等。为止污染， 该区宜保持正压状态。
②
标
本 制 备
io 分装应在生物安全柜内完成。为防止污染，该区宜保持负压 态。为操作方便，标本的分装以及核酸提取也可以在独立生 物安全二级（BSL-2）实验室进行，提取的核酸可以转运至该 区加至扩增反应液中。
③ 核酸扩增和产物分析区：进行核酸扩增反应和产物析。 该区应配备实时荧光定最日仪。为防止扩增产物污染 环境， 该区宜保持负压状态，压力等于或低于标本制备区。
（2）新冠病毒核酸的荧光定量RT-PCR检测。
实验室应当制定标准操作程序（SOP）并严格按照SOP进 行操作。接到标本后，应当在生物安全柜内对标本进行清点核 对，并依撼OP进行试剂准备、标本前处理、核酸提取、核酸扩 增、结果分析及报告。实验室应当建立可疑标本复检的流程。
试剂准备。应当选择国家药品监督管理部门批准的试， 建议选择磁珠法、膜吸附法等进行核酸提取，建议根核酸提 取试剂及扩增体系的要求选择配套的标本采样管不建议免提 取核酸直接进行核酸扩增反应。
②标本处理。使用含胍盐等灭活型采样液的标本无需行 灭活处理，可直接进行核酸提取，而使用非灭活型采样液标 本，按照核酸提取试剂盒的说明，取适量标本加至核提取裂 解液中充分混匀作用一定的时间则可以有效灭活病L不 推荐采用56C孵育0分钟的处理方式灭活病毒该条件不能保 障充分灭活病毒。
污水样本处理可参考《农贸（集贸）市场新型冠状病环 境监测技术规范》（WS/T776 — 2021 ）推荐的方法。
③ 核酸提取。将灭活后的标本取出，在生物安全柜内开 标本采集管加样。或按照核酸提取试剂盒的说明，将标本裂 解液作用足够时间后继续核酸提取步骤核酸提取完成后立即 封盖。取适量核酸加至PCR扩增反应体系中。
④ 核酸扩增。将扩增体系放入荧光定PCR仪，按照试剂 盒说明书设置扩增程序，启动扩增程序。扩增完成后反应不 可开盖，直接放于垃圾袋中，封好袋，不可高压，按般医 疗废物转移出实验室处理。
本指南中的核酸检测方法主要针对新冠病毒基因组中 开放读码框lab （ open reading frame lab, ORFlab）和核
壳
蛋靶标一（ORFlab）:
(
5/-F n
光C
AM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
靶标二（N） 正 .
:
5/-f||-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3/
—12 —
⑤ 结果判断。
阴性：无Ct值、无S形扩增曲线。
阳性：Ct值小于等于检出限，且衲扩增曲线，可报告 为阳性。
灰区：Ct值位于灰区，建议重复实验，若重做值仍处于 灰区，但出现明显的形扩增曲线，该样本判断为阳性，否则 为阴性。
注：如使用商品化试剂盒，则以厂家提供的说明书为准。
⑥ 病例确认。
实验室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个：条
件一：同一份标本中新冠病毒个靶标（ORFlab、N）
实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳惭 检测结果，则需要重新采样，重新检测。
条件二：两种标本实时荧光RT-PCR同时出现单靶标阳 性，或同种类型标本次采样检测中均出现单个靶标阳性的检 测结果，可判定为阳性。
环境与生物材料核酸检测阳性要排除疫苗接种物残留 污染的影响。核酸检测结果假阴性的可能原因包括：样本质 差；样本采集时间过早或过晚；样本保存、运输和处理当； 其他原因如病毒变异、PCR抑制等。
⑦ 质控。
由上级疾控部门对下级疾控实验室进行核酸检测质控 考核，中国疾控中心每年至少开展一次对省级疾控机构实验 室的质控考核，并同时提供全国新冠病毒实验室检测质控案， 省级针对地市级实验室的质控考核每年不少2次。各检测机 构应当加强核酸检测质量控制选用扩增检测试剂盒指定的核 酸提取试剂和扩增仪。
性能验证。临床标本检测前实验室应对核酸提取试剂、提取仪、 扩增试剂、扩增仪等组成的检测系统进行必要的性能验证, 性能指标包括但不限于精密度（至少要有重复性）和最低检 测限。建议选用高灵敏的试剂（检测限＜ 5拷贝 /
° 室内质控。实验室可按照《国家卫生健康委办公厅关医 疗机构开展新型冠状病毒核酸检测有关要求的通知》（国卫办 医函〔2020〕53号）要求规范开展室内质控。每批检测至少有
1
份
弱
阳 物品和环境样本的采集检测,还需在采样前及采样过程 至少设一个现场空白样本及一个运输空白样本,以进行过中 质质量控制。
控室间质评。实验室应常态化参加国家级或省级疾控机组 织的室间质评。对检测量大以及承担重点人群筛查等任务
（
第
的实验室，可适当增加室间质评频率。不按要求参加室间质 的，或室间质评结果不合格的应通报批评并上报国家卫健委， 待室间质评通过后方可开展核酸检测。
2. 病毒全基因组测序。
(1) 测序标本选取原则。结合流调信息和病例传播镶 系,优先选择以下标本开展测序：本土疫情中的首发或期病 例、与早期病例有流行病学关联的关键病例、感染来不明的 本土病例、境外输入病例、入境物品及相关环境阳，标本、疫 苗接种后核酸检测阳性者标本等测序结果应与本地近一个月 的输入病例和本土病例序列进行比对。
(2) 测序要求。以省为单位确定开展新冠病毒全基因！ 测序的单位,包括省、市级疾控机构和科研机构。各省要立 本省输入、本土病例新冠病毒基因组数据库,应具备列对比 分析能力。建议首选膜吸附法(人工)提取核酸,二代测序 技术进行新冠全基因组测序。具备测序条件的省要在接收标 本24小时内开展测序工作,关键样本要求收到榛后一周内提 供测序结果报告,并在获得测序结果后］、时 内将基因序列 原始数据(一般为fastq格式)和测序样本送检单(见附件 10-2)报送中国疾控中心。不具备测序条件的省份要在病例 报告后48小时内将病例标本送达中国疾控中心，中国疾控中 心在获得序列信息启4小时内向送样单位反馈分析结果,并报 国家卫生健康委。
(3) 上送标本要求。如标本需上送至中国疾控中心进 行测序，应同时平行采集次，混入1管中，然后平均分装成2 份，一份由各省（市）及时开展病毒全基因组测序，另一份 应在24小时内启动送样程序，上送中国疾控中心。如果要中 国疾控中心进行病毒分离应确保病毒采样液中不含有灭活剂 成分。
3. 血清抗体检测。
血清抗体检测（胶体金、磁微粒化学发光ELISA）用作 新冠病毒核酸检测阴性病例的补充检测，在疑似病例诊断与 核酸检测协同使用。建议采集急性期（发7天内）和 恢复期 （3-4周后）双份血清进行检测，也可根据临床需要确定采集 时间。抗体检测阳性者应排除新冠疫苗接种因素影响。
三、实验室活动生物安全要求
根据新冠病毒传播特性、致病性和临床资料等信息，病 毒按照第二类病原微生物进行管理，具体要求如下：
（一）实验活动规范。新冠病毒培养、动物感染实验应 在生物安全三级及以上实验室开展；未经培养的感染性材的 操作应当在生物安全二级及以上实验室进行，同时采不低于 生物安全三级实验室的个人防护；灭活材料的操作当在生物 安全二级及以上实验室进行不涉及感染性材料的操作，可以 在生物安全一级实验室进行。
（二）相关样本处置。各省级卫生健康行政部门要根疫 情防控需要和实验室生物安全有关要求，及时研判提出新 冠病毒实验室检测生物样本处置意见。对确需保存的，应尽 快指定具备保存条件的机构按照相对集中原则进行保存或送 至国家级菌（毒）种保藏中心保藏；对无需保存的，相关机 构按照生物安全有关要求及时处理。
（三实验室废弃物处理及实验室污染的处理。参考《疗机 构新型冠状病毒核酸检测工作手册》（试行第二版）
附件：10-1.新冠病毒检测标本送检表
10-2.新冠病毒环境标本送检表
10-3.新冠病毒标本序列测定结果
附件10-1
新冠病毒检测标本送检表
送样单位（盖章） 送样日期：年月日
送样人：
标本
编号
标本类 型
姓名
性别
年龄
发病日 期
就诊日期
采样日期
样本来源
1. 输入病例
2. 本土病例
实时荧光RT-PCR
基因序列*
抗体检测
备注
检测日期
试剂厂家
靶基因
测序日期
测序方法：
1. 二代测序
2. 三代测序
检测日期
试剂厂家
方法
IgM (+/)
IgG (+/)

注：样本来源是§选填1或2，如为输入病例请填写病例来源国家。基因序列*，注明是否完成全基因组测序，如完成，需填写表2信息。
附件10-2
新冠病毒环境标本送检表
送样单位（盖章） 送样日期：年月日
送样人：
标本
编号
标本类型
采样时 间
采样地 点
采样部 位
采样面 积
环境 温度湿度
实时荧光RT-PCR
基因序列*
备注
检测日期
试剂厂家
靶基因
测序日期
测序方法：
1. 二代测序
2. 三代测序
序列覆 盖度
序列比
对结果

注：基因序列*，注明是否完成全基因组测序，如完成，需填详细信息。
附件10-3
新冠病毒标本序列测定结
果
检测单位： 报送日期：年 月
日检测人：
标本
编号
标本类型
姓名
性别
年龄
发病日期
就诊日期
采样日期
样本来源§
1. 输入病例
2. 本土病例
实时荧光RT-PCR
基因测序*
备注
检测日期
试剂厂家
ORFlab
Ct值
N
Ct值
测序日期
测序方法
1. 二代测序
2. 三代测序
序列覆盖度
序列比对结果

注：样本来源是§选填1或2,如为输入病例请填写病例来源国家。基因测序*,如完成全基因组测序需同时提交全基因组序列信息，尽量提交fastq格式文件。