水稻离体花器官的诱导及其分析离体诱导水稻诱导及其离体花器官.pdf

英文缩略表缩写中文名称2,4-D2,4-dichlorophenlxyacetiacid2,4-二氯苯氧乙酸6-BA6-*benzy laden i ne6-芳基噪吟AMV-RTavian myeloblastosis virus reverse禽成髓细胞病毒逆转录酶transcriptionasebpbase pair碱基对BSAbovine serum albumin牛血清蛋白cDNAcomplementary DNA互补DNAddftOdistilled and deionized water重蒸水DEPCdiethyl pyrocarbonate焦碳酸二乙酯E.collEscherichia coli大肠杆菌EBedhidium bromide漠化乙锭EDTAdisodium ethylendiaminetetracetate乙二胺四乙酸GAgibberellic acid赤霉素GUSglucuronidase葡萄糖甘酸酶IAAindole-3-acetic acid.咧株乙酸IPTGisopropylthio-p-D-galactoside异丙基呻-D-硫代半乳糖昔LBluria-bertani mediumLB培养基MOPS3-(Nmorpholino)propanesulfonic3-（N-吗琳代）丙磺酸NAAnaphthalene acetic acid蔡乙酸NaoAcsodium acetate醋酸钠PCRpolymerase chain reaction聚合酶链式反应SDSsodium dodecyl sulfate十二烷基硫酸钠SSCstrandard saline citrate标准柠檬酸盐溶液ssDNAsalmon sperm DNA鞋鱼精DNASTEsodiumchloride,Tris.Cl,EDTA buffer氯化钠、Tris.Cl.EDTA溶液Tristrishydryxymethylaminoroethane三羟甲基氨基甲烷X-gal5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-galac5-澳-4-氯-3-0引噪邛4)-toside半乳糖苗山东农业大学硕士毕业论文摘要本研究以水稻幼嫩的子房为外植体，通过愈伤组织成功诱导了水稻离 体雌蕊和秤片的产生。首先以水稻幼嫩的子房、内秤、外移以及开花后8 天的幼胚为外植体诱导愈伤组织，结果表明外稗和内程不能诱导产生愈伤 组织，而子房和开花后8天的幼胚可以较高频率地诱导产生愈伤组织。实 验中只诱导出了离体雌蕊和程片状结构，并没有观察到雄蕊和浆片等花器 官的再生，且离体雌蕊的分化频率由外植体的年龄、愈伤组织培养基的激 素浓度和分化培养基的浓度共同决定。将愈伤组织转移到分化培养基上以 后，只有以子房为外植体产生的愈伤组织分化产生了花器官。离体雌蕊状 结构在形态上具有雌蕊的特征，如都分为羽状柱头和子房两部分，少数雌 蕊状结构的羽状柱头还具有二叉结构。通过组织切片观察，发现再生雌蕊 与植株上的雌蕊类似，都具有胚珠。利用水稻雌蕊特异表达基因OsMADS3 作为分子marker进行的Northern杂交分析表明，0sMADS3只在离体雌 蕊和植株上雌蕊中表达，从而进一步证明了离体产生的雌蕊状结构具有雌 蕊的特征。再生雌蕊的诱导频率与愈伤组织的诱导条件、外植体的年龄以 及分化培养基的激素浓度有关。另外，离体秤片状结构与植株上的移片在 外部形态上非常相似，但进一步的形态学分析结果显示离体程片状结构的 细胞类型和排列以及主脉数都与植株上的程片显著差异。关键词：愈伤组织花器官激素子房水稻水稻离体花器官的诱导及其分析Regeneration of Floral Organs in Vitro in Oryza sativa.AbstractIn this study the induction of floral organ pistil and palea/lemma from the callus was described in Oryza sativa.For induction of floral organs,different explants-including young embryo,lemma,palea and pistilwere used for callus induction with different combinations of Nd-benzyladenine(6-BA)and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D).High frequencies of callus formation from pistil and young embryo explants were achieved.Floral organs were induced after calli from pistils were transferred to medium containing both zeatin and 2,4-D,The morphological characteristics of the pistil-like organs are very similar to those formed in planta though with minor diflferences.Further histological study revealed that the in vitro pistil contains an ovule within its ovary.Furthermore,a pistibspecific gene,0sMADS3 used as a molecular marker for pistil identity was expressed in the pistiHike organs as it was in pistils in the flower of the plant.Palea/lemma-like structures in vitro are similar to Palea/lemma in planta in their morphology,however,they have different number of main veins and cell types from those in planta as indicated by morphological observation.Keywords:Callus;Floral organ;Hormone;Oryza sativa.Pistil2山东农业大学硕士毕业论文1引言1.1水稻花的发育在一定发育阶段，在环境条件和内部机制的共同作用下，植物顶端 分生组织分化出花序原基，之后分化出花器官原基。营养顶端分生组织 向花序或花分生组织的转变及花器官的发育是植物生活周期中的关键环 节，也一直是植物发育生物学和植物分子生物学的研究热点。水稻作为 单子叶植物的模式植物，其花发育的研究已取得了重要进展。1.1.1水稻花的形态水稻在单子叶植物中具有代表性,其花序的许多特征明显不同于双 子叶植物。水稻花序的单位是小穗，小穗由小花和两个颖片组成,小花从 外到内依次由外移、内移、两枚浆片、6枚雄蕊和一个雌涉，舌子房和两个羽毛状的柱头）组成。水稻的花具有与双子叶植物相彳 点和雌蕊,围绕雄蕊和雌蕊的外移、内秤和浆片，与双子叶植物和其他单子叶植物 的花萼、花瓣明显不同。尽管有很多形态上的比较研究，对禾本科花器官的性质仍没有令人 满意的解释。在各种花器官中，关于浆片的性质一直存在争议，但最近 水稻的浆片相当于双子叶植物的花瓣得到了实验的支持（Kyozuka和 Shimamoto,2002）.关于内程的性质也有多种解释,通常内外移被认为是 苞叶,然而,也有人认为内外移相当于双子叶植物的萼片（Kyozuka等，2000；Munster 等，2001）01.1.2水稻花序及花分生组织（花原基）的发育水稻多数品种是短日照植物，光周期、温周期（Yin等，1996）、叶的 数量、激素等信号都可诱导水稻从营养生长向生殖生长的转变，这个复 杂的转变过程主要涉及开花时间调控基因和花分生组织特征基因。开花 时间调控基因参与从营养分生组织向生殖分生组织的转变，这个转变一 3水稻离体花器官的诱导及其分析旦完成，花序分生组织就开始向花分生组织过渡，最终产生花器官（McSteen等，2000）,现在水稻中已经发现了一些影响开花时间的基因（Yano等，2001）如RCN1和RCN2.在水稻中过量表达RCN1和RCN2,导致开花延迟，并产生具有更多分枝的花序，而且花序分枝的特征不受 影响（Nakagawa 等，2002）o水稻完成营养分生组织向生殖分生组织的转变后，首先形成圆锥花 序原基，之后形成一次枝梗，再形成二次枝梗，然后在二次枝梗和一次 枝梗上产生小穗原基。虽然有人报道至少有20个基因参与控制水稻圆锥 花序的形态（Kyozuka,1999）,但其中只有少数基因及突变体被发现并 深入分析。在plastochronl水稻突变体中，圆锥花序的发育受到严重的影响：许多一次枝梗原基转变成营养枝，之后营养枝上再形成花序轴，而一次 枝梗原基再次转变成营养枝；在一些弱突变体中，营养枝和小穗可以同 时形成（Itoh等，1998）。水稻中叫STOC/ffiQNI基因在发育的叶原基 中起作用，对叶原基的有序产生起计时的作用，并控制着营养生长的结 束和生殖生长的开始（Miyoshi等，2004）。水稻叶的数量作为一种信号 在体内积累，当基因突变以后，这种信号的积累被打 破，导致植物体不能形成正常的一次枝梗原基。另外，力和8EU也是参与决定枝梗分生组织发育和花发生决定 的关键基因。在&突变体中，初级枝梗启动没有受到影响，所以在穗轴 上有正常数目的初级枝梗；但在初级枝梗和更高级的枝梗上没有小花的 启动，取而代之的是更高级的枝梗（Komatsu等，2003）。因此FZP有可 能抑制枝梗原基发育而促进小穗原基的发育。BFL1可能是的 的等位 基因，二者的突变体表型非常相似，物7也没有小花，而且也出现了三 级、四级甚至更高级的枝梗，Zhu等认为麻调控花序分生组织向花分 生组织的转变（Zhu等，2003）oRFL基因参与控制水稻圆锥花序的分枝（Kyozuka等，1998）,并激 活其下游基因（包括水稻中和4G的同源基因）的表达（Chuj。等，2003）,从而最终产生各种类型的花器官。水稻花器官的数目受4山东农业大学硕士毕业论文0RGANNUMBER1基因的控制，该基因通过控制花分生组织的大小来控 制水稻花器官的数目（Takuya等，2004）。1.1.3水稻花器官特征的决定在对拟南芥和金鱼草花发育突变体进行遗传分析的基础上，Coen和 Meyerowitz提出了花器官特征决定的ABC模型（Coen和Meyerowitz,1991）,根据该模型，控制花器官特征的基因被分为ABC三类。被子植 物的四轮花器官由具有不同功能活性的A,B,C三类基因决定，其中A 类和C类基因单独作用分别决定萼片和心皮的特征，A类和B类基因的 共同作用决定花瓣的形成，而雄蕊的产生是B类和C类基因共同作用的 结果。该模型还认为，A类和C类基因互相拮抗，A类基因抑制C类基 因在萼片和花瓣中表达，同时，由于C类基因的抑制，A类基因功能仅 局限于萼片和花瓣。在拟南芥中已经被分离克隆的A类基因包括/PZ和 AP2,B类基因包括/尸3和巴，C类基因为力G。这个模型作为花器官特 征决定的机制已经被普遍接受。通过研究不同种类植物的花器官特征决 定基因，显示出ABC模型同样适用于其他双子叶植物甚至单子叶植物，这大大促进了植物花发育的研究。对矮牵牛中的研究结果表明，D功能基因F3P控制胚珠的特征 决定，ABC模型被扩展为ABCD模型（Colombo等，1995；Angenent 等，1996,随着研究的不断深入，人们发现E功能基因SEPf,SEP2.SEP3是第二、三、四轮花器官正常发育所必需的，进而导致ABCDE模 型的提出（Theissen,2001；Lohman and Weigel,2002）o目前，水稻的A、B、C、D E五类基因已经被分离和分析（表1）。在水稻和拟南芥、金鱼草、玉米中，这五类基因在序列和功能上都有一 定保守性。但这些基因在水稻中的功能跟在其余三种植物尤其是拟南芥 中的功能并不完全一致“A 类功能基因包括凡4尸、RAP1B（Kyozuka 等，2000）、OsMADSl（Jeon 等，2000；Prasad 等，2001）、以及（Fomara 等，2004）,它们是拟南芥API亚群的成员，与玉米A类基因Z4尸1（Bird等，2000）5水稻离体花醇官的诱导及其分析的同源性很高。API亚群的成员有控制成花转变、花器官特征以及果实 发育的作用。RAP1A最初在花原基顶端表达，内外移原基产生后，其表 达部位发生改变，即不在花原基顶端表达，转而在发育中的内外移中积 累转录产物，随后其mRNA在内外移、浆片中较多的积累，在颖片中仅 有微弱表达，不在雄蕊、雌蕊原基中积累转录产物；在幼花序中大量表 达,在成熟小穗中微量表达,但在叶片或根中不表达(Kyozuka等,2000)；而在拟南芥中，API在萼片和花瓣中表达。这一发现支持浆片是双子叶 植物花瓣的同源异型器官的观点。应例主要在分生组织中表达，过 量表达实验表明该基因对水稻的开花时间具有调节作用；在拟南芥中过 量表达OsMADSl&出现类似即1突变体的表型。进一步的酵母双杂交实 验显示，0sMADS18 能与 API 竞争结合 API partners,导致 API partners 减少，引起他/突变体的表型，这也说明OsMADS18不能完全代替API的 功能(Fomara 等，2004)。表1部分拟南芥，金鱼草，水稻和玉米的花器官特征决定基因。Table 1.Genes determining floral organ identities in Arabidopsis,Antirrhinum,maize and rice.拟南芥金鱼草水稻玉米RAPIAAPIRAP1BAAP2SQUAOsMADS18ZAPlOsMADSlOsMADS2AP3DEFBPlGLOPLENAOsMADS4OsMADSl 6 OsMADS3SILCAGZMM2DEFH84RAGAGL11ANTZAG2DBELLIOsMADSl 3ZMM1STKDEFH200OsMADS24ZMM8SEPSEP1 3DEFH72OsMADS456山东农业大学硕士毕业论文B 类功能基因包括。sADS2（Kang 等，1995；Prasad 等，2003）和 OsMADS4（Kyozuka 等，2000；Munster 等，2001）,OsMADS16（Kang 等，1998；Kyozuka 等，1999；Nagasawa 等，2003）,是 Ph GLO 的同 系物。水稻转化反义QsKWS4基因的植株表现为第2轮和第3轮花器 官特征的改变：第2轮花器官的浆片变成内外移状的器官；第3轮的雄 蕊转变为心皮状的器官。SMZD576（也称S8废机7跖WI）基因的cDNA 则是用基因为钓饵通过酵母双杂交的方法得到的，序列分析 表明OsMADS16基因属于AP3基因家族。OsMADS16基因的转录物主 要在第2轮和第3轮花器官中积累，而。SM4DS4基因的转录物可以出 现在第2、第3、第4轮中。和0sM3S4基因的表达方式与 4P3和PI的极其相似。水稻MADS box基因OsMADS2和OsMADS4 与拟南芥的B功能基因PI是高度同源的。C类功能基因有和&G（Kang等，1995；Kyozuka等，2000；Kang 等，1998?Kyozuka Shimamoto,2002）。OsMADS3 与拟 南芥中C类功能基因NG同源（Kang等，1995）,与玉米中的（Schmidt,1993;Theissen等，1995）同源性最高。雄蕊原基产生之后 OsMADS3开始在雄蕊和雌蕊原基中表达，而在内外移和叶片中不表达。实验结果表明OsMADS3是雄蕊和心皮发育所必需的。原位杂交结果显 示，MG在花分生组织以及内移和外移中都检测不到表达信号，雌雄蕊 原基产生之前，RAG mRNA首先在心皮和雄蕊原基产生位置的细胞中积 累，雄蕊产生后，开始在发育中的雄蕊和雌蕊原基中低水平表达（Kyozuka 等，2000）。D 类功能基因为（Zenaida 等，1999）,OsMADSi3 在发育中的胚珠中表达。原位杂交结果显示，在胚珠原基出现以 前不表达，胚珠原基出现以后开始出现表达信号，珠被开始分化时，开 始在珠被中表达，胚囊发育成熟后。在胚珠中只有极弱的表达 信号。与玉米胚珠特征基因24G2和ZMA有较高同源性（Zenaida 等，1999）0通过原位杂交和系统树分析发现，和。sAD5（Favaro 7水稻离体花器官的诱导及其分析等,2002）属MADS族基因的4G2 C4GM/OUS小区?）亚族（Greco 等，1997）。AGL2 SEPALLATAD在拟南芥花分生组织、发育的子房、受精后的胚和种皮中表达，但主要在花器官中表达；B和C类花器官功 能基因起作用需要ZG2的参与（Pelaz等，2000）。随着植物花发育相关基因研究的不断深入，其基因表达的调控机制，包括基因间的相互作用以及外界因子（包括激素）对基因表达的调控作 用正逐步成为研究的热点。1.2激素对花和花器官发育的调节在植物的生长发育过程中，有众多的激素参与并起着调节作用。近年来，激素调节营养器官发育分子机理的研究已取得了一定的进 展。在拟南芥中，生长素通过调节G蛋白基因的表达，控制侧根和不定 根的分化（Ullah等，2003）；PINOID蛋白激酶通过提高生长素的极性运 输来调节子叶和花器官的发育（Benjamins等，2001）,拟南芥苗的再生 需要ESR7基因的表达，该基因的表达受细胞分裂素的调节（Banno等，2001）。细胞分裂素和生长素对细胞周期进行时间和空间上的控制（Stals 和 InzC,2001）a赤霉素、生长素、细胞分裂素等激素与植物的成花有密切的联系（Simpson和Dean,2002）。在白芥属植物中，细胞分裂素或赤霉素通过 激活MADS Box基因（SaMADSy的表达，诱导花芽的形成（Bonhomme 等，2000）。花器官原基的形成以及花器官的发育都要受到赤霉素的调控，很多花发育相关基因都是赤霉素的靶基因，如拟南芥花分生组织特征基 因及4尸丫的活性受赤霉素的调节（Yu等，2004）；最近有研究表明，赤霉 素通过抑制QELL4来提高一种microRNA（miR159）的水平，来延迟 开花时间并影响雄蕊的正常发育（Achard等，2004）。最近的研究表明，许多激素响应基因在植物发育方面起着更为广泛 的作用（Chow和McCourt,2004）,如在拟南芥中COI1对茉莉酸甲酯 起响应作用，当该基因突变以后引起雄性不育，而且其育性不能通过施 8山东农业大学硕士毕业论文加茉莉酸甲酯得到恢复（Benedetti等，1995）。近年来人们开始利用多种方法来研究某种激素在特定器官或特定发 育阶段的作用。CKA7和G4分别编码具有细胞分裂素和赤霉素降解作 用的蛋白，Huang等（2003）利用具有组织特异性的启动子在玉米雄蕊 中表达CKX1和在烟草雄蕊中表达GX/来研究细胞分裂素和赤霉素在雄 蕊发育过程中的作用，并提出这两种激素的水平影响雄蕊的发育。在水 稻中，OsGA2oxl（水稻赤霉素氧化酶2）通过控制具有生物活性的赤霉 素的含量来影响水稻从营养生长到生殖生长的转变（Sakamoto等,2001）。利用突变体进行激素作用分子机理的研究是一条有效的途径，目前在拟 南芥中已经发现了一些与生长素运输和响应有关的突变体，如axrl（Lincoln 等，1990）,coil（Tiryaki Staswick,2002）等。另外还鉴定 出了与细胞分裂素响应有关的突变体，如“el（Inoue等，2001）、cyrl（Deikman 和 Ulrich,1995）、ahk2、ahk3 和 ahk4（Ueguchi 等，2001）等。关于赤霉素的生物合成、代谢、信号传导过程以及对花发育的影响 已经有了比较深入的研究（Olszewski等，2002）,然而关于细胞分裂素 和生长素的信号传导过程以及对花发育的影响却相对了解不多。以下仅 对细胞分裂素和生长素的作用机理研究进展进行论述。1.2.1细胞分裂素的作用机理细胞分裂素在高等植物中是一类控制细胞分裂、顶端优势和衰老的 激素（DAgostino等，1999）,是调节植物分生组织活动和形态发生的重 要因子（Werner 等，2001）。开花过程跟许多其他发育过程一样也受到细胞分裂素的调节（Mok,1994）,开花前后细胞分裂素浓度发生明显变化，这在一些物种如小麦，拟南芥，番茄，小麦，大豆等中已有报道（L句eune等,1988,1994;De Bouille 等，1989；Marcinska I 等,2001；Walter Dewitte 等,1999）,这说明 成花转变与细胞分裂素的浓度变化有关。9水稻离体花器官的诱导及其分析近年来细胞分裂素信号传导的研究取得了重要进展：一、进一步明确了细胞分裂素受体的特征，它们有两种类型，即组 蛋白激酶受体（Hwang和Sheen,2001；Yamada等，2001）和G蛋白耦 合激酶受体（Plakidou-Dymock等，2001）；受体可识别细胞分裂素的种 类并对其中一种或几种具有特异性，例如玉米中三个对细胞分裂素响应 的组蛋白激酶和对各种细胞分裂素的敏感 性不同，ZmHKl对异戊烯基腺噂吟最敏感,ZmMO对反式玉米素及其 核糖昔最敏感，而这三个组蛋白激酶都对顺式玉米素响应（Keiko等，2004二、分离出多种类型的细胞分裂素快速响应基因，受体可直接在转 录水平上激活快速响应基因（DAgostino等，2000；Taniguchi等，1998；Imamura等，1998）。ARR家族成员是细胞分裂素快速响应的转录因子，包括A型和B型，对于细胞分裂素的响应，A型ARR的表达水平保持 稳定，B型ARR则快速而特异的提高（Brandstatter和Kieber/998；Taniguchi 等，1998；Kiba 等，1999；DAgostino 等，2000）；A 型 ARR 仅具有一个信号接受结构域（DDK）,B型ARR是核定位蛋白，具有一 个信号接受结构和一个信号输出区域，其信号输出结构与DNA特异结 合，并能直接激活A型ARR（Hwang和Sheen,2001）和其他一些基因 的转录。在水稻中，细胞分裂素对CWVSHS2启动子的活性有显著的正向 调节作用，序列分析表明该启动子含有与B型ARR基因ARR1结合的 元件（Emily 等，2004）0三、细胞分裂素的生物效应途径进一步清晰，它通过细胞周期蛋白 激酶CDC2、CDC25和细胞周期蛋白CycD3控制细胞分裂（Riou-Khamlichi等，1999；Gaudin等，2000）,通过泛素/26S蛋白酶复合体调 控植物发育。上述研究初步揭示了细胞分裂素信号传导的机制，关于细胞分裂素 对花发育的调控机理了解却很少。在拟南芥中B型细胞分裂素快速响应基因有11个，其中ARR20和10山东农业大学硕士毕业论文U?2?特异在生殖器官中表达（Tajima等，2004）,过量表达实验表明/放?20和W?2/促进部分A型ARR基因的表达，而对部分A型ARR 基因起抑制作用，最终对花器官的发育造成了严重的影响。由此可以说 明，细胞分裂素可以通过特异表达的响应基因间接地对植物的花发育进 行调控。另外，一些调节分化和器官决定的基因也影响细胞分裂素的代谢（Chow和McCourt,2003）,如水稻分生组织细胞的marker基因OS/,通过改变体内赤霉素（GA1和GA4）和细胞分裂素（玉米素）的水平来 调节植物的发育过程（Kusaba等，1998）。要建立细胞分裂素与包括花发育在内的各种发育过程之间的联系，还需要进一步的研究。1.2.2生长素对花器官发育的调节生长素在植物体内的正确分布是控制生长发育的决定因素之一，而 生长素在植物体内的极性运输通过外运载体和内运载体在细胞上的不对 称分布来控制（G百Iweiler 等,1998；Muller 等，1998；Swarup 等，2001）。在拟南芥中，外源生长素IBA和IAA在多数器官中的运输是类似的，但是在花序轴中只有IAA的运输，没有IBA的运输，而且IAA运输的抑 制因子以及IAA运输蛋白的突变体都减弱了 IAA的运输而对IBA的运输 没有影响（Rashotte等，2003）o由此可见，不同外源生长素在植物体内 的运输机制不同，不同种类的生长素的调控作用也可能不同。到目前为止在拟南芥中已发现了一些与生长素运输和响应有关的突 变体，如i pinl（Okada 等，1991）.ettin（Sessions 等，1997）等。对 拟南芥中与生长素有关的突变体的研究表明，生长素参与植物的花发育 过程。PIN1是生长素的外运载体。尸加/突变体失去了形成正常叶、花和花 序的功能，表现为胚叶序，叶片、花序和花结构异常，但保持了形成花 序轴和维持花序分生组织的功能，不能形成正常花芽，其欲分化的花芽 H水稻高体花器官的诱导及其分析呈针状结构，且在夕加1枝中出现IAA极性运输减弱的表型，该突变体开 花需要IAA的极性运输（Okada等，1991；G旬weiler等，1998）。最近 对PIN3的研究表明，该蛋白不对称分布和转化后的重新分布结果证明它 参与了生长素的侧向分配（Friml等，2002；Nicholas等，2004）。由此 可以说明，1AA的极性运输对于正常花芽的形成是必需的。在拟南芥中，FLOOZY参与合成生长素，该基因在早期花器官分生组织的中心表达，之后在花瓣和雄蕊原基中表达，该基因突变以后第一到三轮花器官的早 期发育受到抑制（Tobena-Santamaria等，2002）,这进一步证明了生长素 在花器官发育中的调控作用。ARF是拟南芥中与生长素响应元件TGTCTC特异结合的转录因子（Ulmasov等，1997）,ARF家族的成员ETTIN/ARF3与花器官定位发生 有关.ettin 突变体的花被片数目增加，雄蕊和花药数目减少，雌 蕊出现顶基模式缺陷。原位杂交实验表明，ETT最初在花原基中表达，之后陆续在花被、雄蕊、心皮原基中表达。这说明77在花分生组织特 征分化中发挥功能，从而影响了花被片的数目和空间分布、雄蕊的形成 和雌雄蕊定位分化。在心皮发育之前，77在花分生组织的四周环形表 达，直至出现心皮。因此，77有预先设定心皮原基顶-基发生边界的功 能，这可能与瓯4T如（Heisler等，2001）有关。SR4TULA对心皮边 缘的生长起重要作用，其表达不依赖其它心皮发育相关基因如CRABS CLAW和AGAMOUS。Heisler认为在发育中的雌蕊的远轴端ETTIN抑 制57%77忆4的表达，从而导致心皮原基顶-基发生边界。生长素的信号传导途径及其调控机制已有重要进展，但生长素信号 传递网络很复杂，尤其对植物花发育调控机制还有待进一步研究。1.3建立离体花器官再生系统的意义Che等（2003）利用寡聚核甘酸微阵列技术，分析了拟南芥的苗再 生过程中，生长素和细胞分裂素调节的基因的表达，发现激素正调节部 分基因的表达，同时也负调节部分基因的表达.上述研究表明，离体实 验系统为研究激素调节器官发生的分子机制提供了一条有效途径。山东农业大学硕士毕业论文虽然生长素和细胞分裂素信号传导机制的研究已有重要进展，但最 终如何调控植物花分生组织产生和花发育过程仍不清楚。建立一个高效 的花器官再生系统无疑会为研究激素调节花器官特征决定的机理提供极 大的便利1.4离体花器官再生系统研究的现状目前为止，离体花器官的再生已经在许多植物中取得了成功。花器 官的再生系统大体可以分为两类：第一类是直接从外植体上再生花器官;第二类是通过愈伤组织组织直接再生花器官。第一类再生系统到目前为止已在烟草、花生、红花、黄瓜、玉米、风信子等植物中获得成功。1973年Tran Thanh Van M首次报道了烟草薄 层培养产生花芽；Narasimhulu Sb和Reddy GM在1984年报道了花生子 叶在离体条件下直接开花并结果荚。同年，TejovathiG和AnwarSY报 道了红花子叶在离体条件下直接产生头状花序，并指出0.1鸣/LNAA有 利于子叶的直接开花；79天龄黄瓜无菌苗的完整子叶，在添加不同 生长调节剂的MS培养基上培养820d左右，其营养芽和花芽直接从子 叶基部的表面长出，直接形成花的最高频率达25%,1.5mg/L左右浓度 的KT有利，而生长素一般不利于子叶上花的形成，单独添加亚精胺对 花形成无促进作用（庞基良等，1994）。李学红和张举仁（1999年）将6 个玉米自交系的茎尖在含6-BA和DBA的培养基上培养，培养物在产生 丛生芽的同时，分化出了大量的雌雄花序。陆文梯等先后报道了以风信 子花被片为外植体成功诱导了花芽、花被片、雄蕊、心皮和胚珠的直接 再生。第二类再生系统已在小麦，花叶千年木（陆文楔，2002）等植物中 取得成功。从花粉发育时期为减数分裂一单核中期的小麦幼穗上分离内 移和外程为外植体，可以通过愈伤组织直接再生小穗及雌蕊状结构，所 得的再生小穗基本上是雌蕊发育得好而且多，雄蕊少且发育得不好（陆 文楔等，1992）。1997年刘思衡等报道了将长2-3 cm的小麦幼穗切段接 种于培养基上得到愈伤组织，之后在愈伤组织上直接再生出5 4个试管 13水稻离体花器官的诱导及其分析变态小穗，其颖片和小花柄明显伸长，呈簇生状或分枝状，比正常的大 28倍，花器发育完全，然后在无菌条件下授以黑麦花粉，产生了杂 交种子，经离体胚培养能产生幼苗：然而，作者对这一结果并不是很确 定，他认为所得到的再生小穗并非从愈伤组织而来，可能是从本来的花 分生组织分化得到的。以小麦的未成熟胚为外植体可在愈伤组织上直接再生雌蕊（吴碧华 等，2003）,再生雌蕊起源于再生芽附近的分生组织细胞，并通过此生雌 蕊再生的方式形成丛生状；再生雌蕊除了具有单生胚珠，还发现了双生 胚珠；并且离体雌蕊的再生频率与小麦的基因型有密切的联系。以小麦为材料的花器官再生系统还不是很成熟，报道的再生频率都 比较低；小麦为异源六倍体，其基因组比较大，而且遗传转化又比较困 难，不利于做进一步的研究。以烟草、红花等几种植物为材料的花器官 再生系统都存在着花器官的再生不能定向控制的缺点，这也不利于对花 器官发育的分子机理作进一步的研究。在这些已报道的再生系统中以风信子离体花器官的再生系统最为 成熟。在风信子的花器官再生系统中，以花被片为外植体，在高浓度激 素条件下，能诱导花被片的不断再生；当外植体从含高浓度激素的培养 基转移到含低浓度激素的培养基上时，能够诱导子房和胚珠的再生（陆 文楔，1991、1992、1999、2000）.这个实验系统成功的打破了植株上各 类花器官在时间和空间上的高度复合状态，实现了单一花器官的定向控 制，建立了花器官的种类与激素浓度之间的对应关系。进一步研究工作 揭示出，在离体条件下，高浓度外源激素通过激活胡和左也MSI的表 达促进了再生花芽和花器官的分化（Li等，2002；宿红艳等，2004）o然而风信子花器官的离体再生系统也有很大的缺陷，首先到目前为 止对风信子的遗传背景了解太少，另外风信子的遗传转化非常困难，这 些都非常不利于对风信子花器官决定的分子机理做更深入的研究1.5课题研究思路14山东农业大学硕士毕业论文水稻作为世界上重要的粮食作物，具有风信子不可比拟的优点。首 先，水稻的基因组较小，随着其基因组测序的完成（Yu和Goff等，2002）,它已成为植物分子生物学和遗传学研究中单子叶植物的模式植物，另外,近年来的研究表明水稻的遗传转化比较容易（历乳1994；易自力等，2001）o因此，建立水稻花器官的离体再生系统将会为研究水稻花器官特 征决定的分子机制以及激素的调节作用提供更大的便利。到目前为止国际上尚未有水稻离体花器官再生的报道，本研究以水 稻为实验材料，利用生长素2,4D和细胞分裂素6.BA与玉米素，通过 愈伤组织直接再生离体花器官，以期建立一个高效的花器宫再生系统，以期为研究激素调节的水稻花器官发育的机理提供便利。15水稻离体花器官的诱导及其分析2材料和方法2.1实验材料2.1.1植物材料粳稻(Oryzasativa)中花11号。四月底育苗，五月中旬插秧栽植。2.1.2菌株和质粒本研究所用的大肠杆菌菌株为Exoli DH5a,克隆载体为pGEMT easy vector(Promega)2.1.3醉和生化试剂TaqDNA聚合酶购自上海生工生物工程公司。AMV逆转录酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶Ncol购自大连宝生物公司。2,4-D,6-BA以及玉米素等植物激素均购自Promegao2.2实验方法2.2.1植物组织培养2.2.1.1水稻愈伤组织的诱导花粉的发育可分为花粉母细胞时期、减数分裂期、单核早期、单核 中期、单核晚期和二核期。当水稻花粉的发育时期在花粉母细胞时期至 单核晚期，水稻剑叶的叶枕与倒二叶叶枕的距离为10cm至忏5cm之间(经 验值)取内移和外移以及子房进行组织培养。截取含有幼穗的稻茎，用70%酒精擦拭35遍进行消毒。然后在无 菌条件下，在无菌培养皿上剥取小花，然后取内移和外稗、幼嫩的子房 16山东农业大学硕士毕业论文作为外植体，接种培养基上，以诱导产生愈伤组织。取花药用醋酸洋红 染色对花粉进行镜检，以确定外植体的发育时期。水稻开花后8天，截取稻穗，并浸泡于70%酒精中消毒5分钟，然 后在无菌的培养皿中取幼胚接种到用于诱导愈伤组织的培养基上。愈伤组织诱导培养基以MS为基本培养基，附加蔗糖3%,用1N NaOH调pH值至5.8,2,4-D和6-BA按需要加入。接种后置于25c培养 箱中进行暗培养。接种在愈伤组织诱导培养基上的植物材料，在接种后4天、8天、12天、16天观察愈伤组织的诱导及生长情况，并在接种后16天统计诱 导频率。2.2.1.2水稻离体花器官的分化愈伤组织生长到8周左右转移到分化培养基上进行培养。分化培养 基以MS为基本培养基，附加蔗糖3%,用IN NaOH调pH值到5.8,2,4-D 和玉米素按需要加入。培养温度为25C,光照条件为每天10小时光照，14小时黑暗。转移到分化培养基上一周以后，每天在解剖镜下观察一次。培养4 周左右统计花器官的诱导频率(具有花器官类似结构分化的愈伤组织数 占分化培养基上愈伤组织总数的百分比，作为花器官的诱导频率2.2.2植物组织切片及观察2.2.2.1取材固定(1)固定液的配制固定液选用4%戊二醛。首先配制原液I和原液II,原液I为浓度为 0.2mol/L的NaH2P0%原液II为浓度为0.2mol/L的Na2Hpe)心 然后配置2 XpH缓冲液(pH=7)：将原液I和原液H混合，并且原液1/原液II-0.644。水稻离体花器官的诱导及其分析戊二醛用2XpH缓冲液和50%戊二醛配制，最后用水定容，使得戊二醛 的终浓度为4%o（2）取材固定分别取植株上的雌蕊、内移和外移，以及离体再生的雌蕊状结构和移 片状结构，立即投入固定液，用针筒抽气，以加快固定液渗透，更换一次 固定液，放置过夜。2.2.2.2脱水、透明、浸蟠、包埋（I）固定好的材料首先用IXpH缓冲液洗两遍，再用蒸馈水洗两遍，然后经 10%、30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%无水乙 醇分别脱水1小时。（2）用二甲苯置换材料中的乙醇,具体方法是：100%无水乙醇、50%无水乙醇50%二甲苯、100%二甲苯、100%二甲苯，每级各1小 时。（3）浸蜡：50%二甲苯-50%石蜡 过夜，纯