神经组织.pptx

<p>,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,#,Click to edit Master title style,单击以编辑母版标题样式,单击以编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,#,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,#,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,#,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,#,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,#,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,#,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,#,Click to edit Master title style,神经组织,神经组织的组成,神经组织的基本结构和功能单位,神经元之间的联系,-,突触,神经系统的组成,中枢,神经系统（,CNS,）,外周,神经系统（,PNS,）,神经元细胞,神经胶质细胞,神经干,神经节,神经系统的基本元件,尽管神经系统的功能如此繁多复杂，而组成中枢神经系统的基本元件只有两个：,神经元,-,神经纤维,神经胶质细胞,神经元,数量：数百到,1000,亿（,45%,）,结构：胞体、树突、轴突和髓鞘,形态：单极、双极和多极细胞,根据细胞突起的数目分：,多极神经元,双极神经元,单极神经元,神经元的分类,感觉神经元（传入神经元）多为假单极神经元,运动神经元（传出神经元）多为多极神经元,中间神经元主要为多极神经元。,根据功能分,接受、整合和传递信息,物质运输,轴浆运输,营养和再生功能,神经元的功能,中枢神经系统的胶质细胞,纤维性星形胶质细胞,原浆性星形胶质细胞,参与构成血,-,脑屏障,星形胶质细胞,少突胶质细胞,中枢神经系统的髓鞘形成细胞,小胶质细胞,具有吞噬功能,室管膜细胞,室管膜细胞可分泌脑脊液，,并参与脑脊液,-,脑屏障的构成。,神经元形态与结构,形态多种多样，大小各异,HE,染色,镀银染色,组成,胞体,突触,髓鞘,神经元结构,细胞核,核周质,胞体,营养中心,核仁明显,多种细胞,器丰富,尼氏体,核周质,神经原纤维,神经元结构,定义：,神经元胞质中的嗜碱性物质。,组成：,粗面内质网和核糖体。,功能：,合成蛋白质。,尼氏体,定义：,银染切片中胞质内呈棕黑色的细丝。,组成：,神经丝和微管成束排列。,功能：,构成细胞支架，参与物质运输。,神经元纤维,神经纤维,神经纤维,有髓神经纤维,无髓神经纤维,髓鞘：,参与形成神经纤维的胶质细胞的细胞膜反复包裹卷轴突而形成的多层膜性结构。,有髓神经纤维：,跳跃式,，故速度快。,无髓鞘和郎飞结，故其传导为非跳跃式，速度慢。,周围神经纤维,周围神经系统的有髓神经纤维,有髓神经纤维模式图,髓鞘的形成,中枢神经系统的有髓神经纤维,由少突胶质细胞突起末端的扁平薄膜包卷轴突而成。每个细胞均有多个突起包绕多条轴突。,少突胶质细胞外无基膜。,髓鞘内无髓鞘切迹。,无髓神经纤维,（,1,）周围神经系统的无髓神经纤维：,雪旺细胞沿轴突一个接一个地连 接成连续的鞘，但不形成髓鞘，因此无朗飞结。一个雪旺细胞可包裹多条轴突，外有基膜。,（,2,）中枢神经系统的无髓神经纤维：,裸露的轴突行走于有髓神经纤维或神经胶质细胞之间。,周围神经系统无髓神经纤维,神经末梢,（一）感觉神经末梢感受器,游离神经末梢,触觉小体,环层小体,肌梭,（二）运动神经末梢效应器,躯体运动神经末梢,内脏运动神经末梢,神经末梢,运动终板,分布：,骨骼肌。,功能：,引起肌纤维收缩。,内脏运动神经末梢,内脏运动神经纤维较细，无髓鞘。其末梢部位,轴突分支呈串珠膨大，称膨体,。体内有许多突触小泡，内含乙酰胆碱或去甲肾上腺素或肽类神经递质。膨体是与效应细胞建立突触的部位。,突触,神经元与神经元之间无原生质相连，但是，信息可由一个神经元传递给另一个神经元，信息的传递依靠它们之间的特殊部位-,突触,来,进行。,突触的分类,突触的结构,突触传递,神经递质与受体,突触的分类,（,1,）按突触形成部位分：,轴,-,树、轴,-,轴、轴,-,体、树,-,树突触,（2）根据突触信息传递的方式分：,化学性突触,和,电突触,（3）按对后继神经元的影响分：,兴奋性突触,和,抑制性突触,按突触形成部位分类,神经元胞体 突触小体,两个神经元相接触的部位就称之为突触,(synapse),轴突末梢膨大呈球形称之为突触小体,神经元胞体及表面的突触小体,扫描电镜像,根据突触信息传递的方式分,电突触,化学性突触,根据突触信息传递的方式分,化学性突触,突触前膜,突触间隙,突触后膜,电突触：两个膜形成缝隙连接，无前膜后膜之分。,化学突触模式图性,轴突终末,出胞作用,突触前膜,突触间隙,突触后膜,兴奋性与抑制性突触,兴奋性突触后电位产生机制,抑制性突触电位产生机制,神经递质与受体,神经递质,指是指突触前末梢处释放，能特异性作用于突触后膜受体，并产生突触后电位的信号物质。,外周递质,乙酰胆碱（,Ach,）,全部植物性神经节前纤维；,绝大多数副交感神经节后纤维；,去甲肾上腺素（,NA,）,绝大多数交感节后纤维。,嘌呤或肽类,主要存在于胃肠道。,中枢递质,乙酰胆碱,:,多数为兴奋作用,单氨类,:,NE,，,5-HT,，多巴胺,氨基酸,:,谷氨酸、天冬氨酸、,GABA,、甘氨酸,肽 类,:,神经肽,神经递质的受体,细胞膜或细胞膜内能与某些化学物质（神经递质或化学激素）发生特异性结合并诱发产生生物学效应的特殊生物分子,-,受体,胆碱能,受体：,M,受体，,N,受体,肾上腺素能,受体：,受体，,受体,突触前受体,:,中枢递质的受体,:,还有,5-HT;GABA;,多巴胺等,烟碱型受体（nicotinic,receptor,）,毒蕈碱型受体（,muscarinic receptor,）,中枢神经系统的胶质细胞,室管膜,细胞,小胶质,细胞,神经元,胶质,界膜,有髓神,经纤维,星形胶,质细胞,毛细血管,有髓神经纤维,内皮细胞,少突胶质细胞,图,15,中枢神经系统的神经胶质细胞,中枢神经系统神经胶质细胞的形态,原浆性星形 胶质细胞,小胶质细胞,少突胶,质细胞,纤维性星形 胶质细胞,银染,银染,三种胶质细胞的镀银染色光镜图,星型胶质细胞光镜图,少突胶质细胞光镜图,小胶质细胞光镜图,中枢神经系统神经胶质细胞,原浆性星形胶质细胞,突起较短粗，分支较多,纤维性星形胶质细胞,突起细长，分支较少,少突胶质细胞,梨形或椭圆形，突起细而少,分支少核圆、染色较深,中枢神经系统神经胶质细胞,小胶质细胞,血液中的单核细胞,来源,胞体最小核染色深突起细长,形态,吞噬,细胞碎屑及变性髓鞘,功能,周围神经系统的胶质细胞,雪旺,细胞（,Schwann cell,）,圆筒状、展开似梯形。扁平，核椭圆，胞质少。参与形成神经纤，保护、绝缘、形成髓鞘。,卫星细胞,（,satellite cell,）,扁平、立方状。包裹在神经节内，神经元的胞体外，起保护、营养、绝缘作用。,神经节假单极神经,元及卫星细胞,HE,高倍,常用神经系统的观察研究方法,1.,经典神经解剖学的组织染色技术,Nissl,染色：显示神经细胞构筑的 银浸染法：显示细胞形态及神经原纤维如,Golgi,法、,Caja1,法,Weigert,染色法：显示髓鞘,2.束路示踪技术 辣根过氧化物酶（,HRP,）,轴突逆行示踪法 荧光色素逆行标记法 细胞毒植物凝集素示踪法,神经束路示踪,利用轴浆运输现象追踪神经元之间联系的一种方法。,示踪剂：,HRP,（,horse radish peroxidase,，辣根过氧化物酶），快蓝（,fast blue,），荧光金（,fluorogold,），核黄（,nuclear yellow,），神经生物素（,neurobiotin,），生物素化葡聚糖胺（,biotinylated dextran amine,BDA,）,荧光染料示踪法,1,，荧光染料的配制：,2,，荧光染料的注射：,3,，动物存活期：一般存活,2-4,天。,4,，灌注固定、取材、冰冻切片。,5,，贴片后荧光显微镜观察：荧光容易褪 色，贴片后应立即观察。,常用神经系统的观察研究方法,化学神经解剖学技术,组织化学法 酶组织化学法 免疫细胞化学法,放射自显影技术原位杂交技术共聚焦显微镜技术,神经细胞,嗅鞘细胞,神经干细胞,骨髓基质细胞,雪旺细胞,嗅鞘细胞,嗅球,嗅鞘细胞的分布,嗅鞘细胞,嗅鞘细胞,嗅觉和味觉,嗅觉产生机制,嗅鞘细胞,桥接脊髓损伤两端，促进轴突再生并髓鞘化,嗅鞘细胞,的修复作用,分泌促进神,经生长的因子,(如NGF,BDNF,GDNF等)促进,轴突的生长,并抑制疤痕的形成,大鼠嗅球的获取,打开前颅，在显微镜下完整地取下嗅球,断颈，取下头颅,切开双颊至颈椎,大鼠常规碘伏消毒皮肤,A,B,C,D,立即将嗅球放入冰的DMEM抗菌液中,剥下嗅球被膜，准备培养,E,F,嗅鞘细胞的纯化培养,剪碎嗅球,加0.2%胰酶孵育20min,加2ml DMEM终止消化,离心，除悬液，换液两次,除上清，置于培养板内培养,改良Nash差速贴壁法培养20h,置于加入多聚右旋赖氨酸的培养板中培养,差速贴壁第二天加Ara-c培养,吸出细胞悬液,每2-3天半量换液一次并冲洗,24h,1h,4-5d,差速贴壁培养法,成纤维,细胞,星型胶,质细胞,嗅鞘细胞,贴壁,时间,差速贴壁法:利用成纤维细胞、星形胶质细胞和溴鞘细胞的贴壁时间不同而将它们分离的方法。,主要杂细胞：成纤维细胞，星型胶质细胞,在杂细胞贴壁后马上将培养液转移到另一个培养基中继续培养，从而达到分离纯化的目的。,Ara-c(阿糖胞苷)对成纤维细胞有抑制作用，故培养过程中常加入Ara-c以抑制成纤维细胞的生长,加入,Ara-c,嗅鞘细胞的免疫组化鉴定,嗅鞘细胞的免疫鉴定为P75NGFR、GFAP、S100、N-CAM、Laminin等呈阳性反应,其中以P75NGFR最为常用，P75NGFR又简称P75：低亲和力神经生长因子（NGF）受体抗体,该标记分子在雪旺氏细胞亦呈阳性,Science,Vol 304,Issue 5672,833-834,7 May 2004,细胞活力鉴定-台盼蓝染色法,原理：台盼蓝可穿透死细胞的膜，将解体的DNA 染成淡蓝色;而活细胞能阻止染料进入细胞内。,步骤:,1、制备单细胞悬液。并作适当稀释（106 细胞/ml）,2、染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。,3、计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞,台盼蓝染色法,结果统计：,镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。,根据下式求细胞活力：,活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）100,注意事项：台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。,哺乳动物干细胞的基本特征,干细胞的自我增殖特征,（1）自我更新：通过分裂产生至少一个干细胞,对称分裂示意图,不对称分裂示意图,干细胞的分化,定义:同源细胞逐渐变为形态、功能和生化特征等方面性质稳定的另一类型细胞的过程,干细胞的可塑性表现为转分化和去分化现象,转分化,：指一种组织类型的细胞在适当条件下分化为另一种组织类型的细胞。,成年雄鼠造血干细胞,成年雌鼠体内,在雌鼠的神经胶质细胞内检,测到Y染色体,去分化：一种干细胞向其前体细胞的逆向转化,干细胞的可塑性,干细胞的分类,按发生学来源：,胚胎干细胞,成体干细胞,胚胎干细胞,神经干细胞,按分化能力：,全能干细胞,多潜能干细胞,多能干细胞,专能干细胞,干细胞的分类,神经干细胞,神经干细胞：存在于胚胎和成体脑组织特定部位中，具有,自我更新,、分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞能力的未成熟细胞。,神经祖细胞,神经前体细胞,神经干细胞的生化特性,特征性标志：巢蛋白nestin表达阳性,神经干细胞,Nestin,是最晚被识别而且是最大的中间丝，其分子量为,210-240KDa,。由于它的氨基酸序列与其它已知的任何中间丝都不一样，所以将,nestin,划分为,类中间丝。在早期胚胎发生的神经上皮干细胞中以及发育着的骨骼肌中有,nestin,的强表达。,胚胎时期：,神经板,细胞,胚胎时期：嗅球、纹状体、侧脑室、室管膜上皮、脑室下带、海马（齿状回）、脊髓、小脑和大脑皮层,成体神经干细胞存在的部位,海马（,hippocampus,），脑室下区（,subventricular zone,），,嗅球（,olfactory bulbs,），鼻上皮细胞（,nasal epithelium,），视网膜（,retina,），脊髓（,spinal cord,）,神经干细胞的分布,神经干细胞的多潜能分化,神经元,星形胶质细胞,少突胶质细胞,神经干细胞的增殖及分化,分化的调控机制 宿主移植部位的微环境,生长因子,A.去除生长因子可以使神经干细胞进入分化状态,B.不同生长因子具有诱导神经干细胞定向分化作用：,CNTF 星形胶质细胞GDNF 雪旺细胞,甲状腺素T3 少突胶质细胞,bFGF 和 LIF 神经元,2.神经细胞黏附分子：细胞外基质蛋白，调节细胞间的相互作用和神经元迁移、轴突延伸和基因表达的发育过程。,3.氧浓度：影响CNS前体细胞增殖分化的重要因素。,分化的途径,神经干细胞的分化机制,神经干细胞的增殖及分化机制,神经干细胞的标记,Brdu标记（检测细胞增殖）,Nestin musashi Sox2,CD133,花生凝集素 PNA，热稳定蛋白阴性,Brdu标记法原理,细胞增殖S期中合成DNA，各种构成DNA的原料掺入到DNA中。,BrdU类似胸腺嘧啶，可掺入合成的DNA中。掺入的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上显示。,该技术可应用到跟踪检测移植细胞的存活、分化和功能状态。,Brdu标记法操作步骤,终止细胞培养前，加入BrdU（终浓度为30g/L），37，孵育40min。,弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。,甲醇/醋酸固定10min。,经固定的玻片空气干燥，0.3H2 O2-甲醇30min灭活内源性氧化酶。,5正常兔血清封闭，,甲酰胺100，5min变性核酸。,按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10,个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数（LI）。,冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗,（工作浓度1：50），阴性对照加PBS或血清。,神经干细胞的应用,神经干细胞的来源,NSC,主要从以下几种途径获得：,(1),来源于神经组织,(2),来源于胚胎干细胞、胚胎生殖细胞等细胞的定向诱导分化,(3),来源于血液系统的骨髓间质干细胞,(4),来源于永生化细胞系,C17-2,细胞系,-,由新生小鼠小脑外颗粒层细胞通过逆转录病毒转导,V-Myc,后获得的克隆多能干细胞系）,MHP36,细胞系,-,（从转导温度敏感型,tsA58,原癌基因的转基因小鼠的海马增殖区获得，是一种温控型,NSC,。在体外,33,时增殖，在体内较高温度,37,时分化成神经元和胶质细胞）,NT2,细胞系,-,（从人睾丸生殖细胞肿瘤中获得，在维甲酸的诱导下表现出,NSCs,的特性）,;,(5),体核细胞转移技术获得,NSC,。,神经干细胞的来源,神经干细胞的培养纯化,取大脑组织,无菌,PBS,漂洗后，剥离脑膜，切取皮质,剪碎组织,加培养液，过滤，离心并收集细胞,细胞重悬于B27和20ng/ml bFGF的DMEM/F12培养液,以2105个细胞/ml接种于玻璃培养瓶37C 5%CO2培养,4d后，离心收集未贴壁生长的细胞用,DMEM,和,10%,胎牛血清培养,更换新鲜培养液，稍加吹打分散成小细胞团，再培养,4d后重复此步骤一次，以后每57d传代一次，传代采用200目不锈钢网机械法分散细胞。,神经干细胞的分化,细胞因子,特殊蛋白质和激素细胞,化学试剂,中药成分及复方脂腺,诱导分化的因素,其他局部环境因素,脊髓,脊髓损伤,赵楠，昆明医学院博士学位论文，,2007,轴突生长相对过慢，胶质瘢痕形成过快,不利,因素,再生促进因子不足，抑制因子存在,不利,因素,中枢胶质细胞在再生中作用的双向性,不利,因素,有利,因素,影响脊髓损伤恢复的因素,神经营养,因子（,NTFs,）,再生抑制,蛋白抗体,各种神经细胞的修复作用,CNS,损伤后的变化,1.,神经元存活，近端出芽再生,2.,神经元死亡，附近未损伤者侧枝出芽,3.,轴突侧枝损伤，未损伤侧枝出芽,CNS,损伤后的变化,脊髓损伤的移植治疗方法,神经因子结合桥接体移植,自体周围神经移植,中枢神经组织移植,采用带血管蒂的自体周围神经与胚胎中枢神经组织神经干细胞联合移植,神经干细胞移植,运用基因工程手段大量扩增骨髓间质细胞,治疗同一个患者,骨骼及相关疾病,中枢神经系统疾病,局部麻醉，抽取骨髓,人体骨髓的获取-骨髓穿刺术,骨髓间充质细胞,Mesenchymal Stem Cells,Easy isolation,high expansion,reproducible,骨髓间充质干细胞的培养纯化,取Wistar大鼠1只麻醉,无菌条件下取大鼠双下肢，剪除软组织，留取股骨和胫骨,将骨骺端剪去，暴露两端骨髓腔,DMEM/F12培养液反复冲洗骨髓腔,冲洗液收集于无菌离心管中，离心，弃上清，加入体积分数0.10血清培养液，充分吹打至单细胞悬液,调细胞浓度为4108/L,接种于培养瓶中,置于,37,、体积分数,0.05 CO2,培养箱中培养,48 h,后全量换液，去除未贴壁细胞,以后每,34 d,换液一次，待细胞长至,80,90,融合后，用含,0.2 g/L EDTA,及,0.25 g/L,胰酶的消化液消化，以细胞密度,4108/L,接种传代,BMSCs的分化,BMSCs的体外诱导分化方法,抗氧化剂作诱导剂，如：,2-琉基乙醇,2%二甲基亚枫,硫代甘油,生长因子作诱导剂，如：,血小板衍生生长因子 PDGF,表皮生长因子 EGF,肝细胞生长因子 PGF,胰导素样生长因子 IGFs,BMSCs的鉴定,BMSC以0.25%胰蛋白酶/1m MEDTA消化10分钟,1,离心,(10gX10,分钟,),，,pBS,洗,2,次,2,离心后以PBS重悬,3,细胞孵育在PE结合的抗大鼠CD90单抗和FITC结合的抗大鼠CD45单抗中30min,4,孵育后,PBS,洗,2,次，然后进行流式细胞分析,5,采用流式细胞方法检测培养细胞表面的骨髓基质细胞标志CD90和造血细胞标志CD45。,MSCs,的鉴定,MSCs,的表型不均一，分别具有间充质细胞、上皮细胞和内皮细胞的特点,MSCs,阳性表达的抗原,:SB-10,、,SH-2,、,SH-3,、,SH-4,、,CD29,、,CD44,、,CD71,、,CD90,、,CD106,、,CD120a,和,CD124,等,MSCs,阴性表达的抗原,:CD1a,、,CD11b/c,、,CD31,、,CD34,、,CD14,、,CD45,、,CD56,、,ESA,等,免疫磁珠法分选细胞,操作过程,超级顺磁性的 MACS （微型磁珠）标记细胞,把这些细胞通过高梯度磁场中的分选柱；标记细胞滞留在柱里而未标记细胞则流出,将分选柱移出磁场，洗脱滞留柱内的细胞,原理,已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合,BMSCs的免疫磁珠法,Stro-1+是用CD34阳性骨髓细胞进行免疫产生的IgM单抗，能识别一种人骨髓基质成分表达的表面抗原,Stro-1+是骨髓基质干细胞的表面标志，可作为一种有价值的抗体，与免疫磁珠分离技术相结合用来鉴定、分离和功能检测人骨髓基质干细胞。,雪旺细胞,圆筒状、展开似梯形扁平，核椭圆，胞质少,形态：,保护、绝缘、形成髓鞘,功能：,雪旺细胞修复神经损伤,合成结构性细胞外基质，包绕有髓纤维形,成髓鞘和基底膜,分泌合成多种促神经生长物质,吞噬髓鞘碎屑，为神经再生通畅道路,增殖迁移形成Bngner带，,支持引导再生锥生长,A,B,C,D,释放生物活性因子，表达多种细胞粘附分子和,受体,导向作用，充当神经轴突的导管,E,F,雪旺细胞的分离纯化,脱颈法处死仔鼠，75酒精消毒，Dhanks液冲洗。,切开股骨干后外侧皮肤，取双侧坐骨神经，置于Dhanks液中,剥除神经外膜，分离得到神经束。Dhanks液漂洗3次。剪成碎块,用吸管将其移至离心管中。加入025的胰蛋白酶和1 ml 02的I型胶原酶37混合消化。,吸弃上清液，再加入02的I型胶原酶4 ml，37消化，消化过程中每隔20 min振荡消化液一次以利于消化。,消化结束后，利用玻璃吸管进行机械吹打，直至溶液呈混悬状，无明显肉眼可见组织,1 000 r/min离心5 min，吸弃上清并加入DF12培养液4ml(含体积分数为20胎牛血清),终止消化，再次1 000 rmin离心5min，吸弃上清，加入DFl2培养液4 ml(含体积分数为20的胎牛血清)吹打混匀,计数后将细胞悬液接种于塑料细胞培养瓶，置体积分数为5的CO2孵箱中37培养。,雪旺细胞的鉴定,S-100,免疫细胞化学染色,接种到24孔板中，5CO：37培养,加入RabbitAntiS100(1：100，1抗)，,4过夜。PBS洗3次，每次2min,至细胞长成单层时，取出盖玻片，浸入PBS漂洗,2次，4多聚甲醛固定60 min,取出固定的细胞片，用PBS,洗5min，浸入075H2O2-PBS振洗2次，每次3 min,取对数生长期细胞，025胰蛋白酶消化，制成细胞悬液,加入生物素化羊抗兔IgG(2抗)，,37，20 min。PBS洗3次，每次2min,水浴30 min后加入ABC复合剂着色(ABC法)。此外加入,荧光素标记IgG可以行免疫荧光染色。显微镜下观察并照相。,Thank you!,</p>