免疫荧光技术操作步骤.docx

免疫荧光技术操作步骤
直接免疫荧光法测抗原
基本原理
将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）： 0.01mol/L,pH7.4
荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L,pH7.4的 PBS 15ml）
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
荧光显微镜
玻片架
滤纸
37°C温箱等。
实验步骤
1.滴加0.01mol/L, pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度.
2.滴加适当稀释的荧光标记（饱和浓度可以用滴度发或公式法算出）的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温30min定时间（参考：30min）.
3.取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/LpH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3 5 min不时振荡。
4.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5.立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：
（一）无荧光；（土）极弱的可疑荧光；（+ ）荧光较弱,但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++++++ ）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++ ”以上，而各种对照显示为（土）或（一），即可判定为阳性。
注意事项
1.对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在1: 20 1之间，要自行摸索最佳梯度,建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2.染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25C左右），高于37C可加强染色效果，但对不耐热的抗原伽流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2C的低温，延长染色时间。低温染
色过夜较37C30 min效果好的多.
3.为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰.
（1）标本自发荧光对照：标本加1 2滴0.01mol/L pH7o 4的PBS.
（2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
4.一般标本在高压灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。