流式细胞仪.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,流式细胞术,原理与应用简介,湖北中医学院中医药实验中心 田代志,流式细胞术发展史,1930,年,Caspersson,和,Thorell,开始致力于,细胞计数,的研究,1934,年,Moldaven,最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根,毛细管,的细胞,1940,年,Coons,提出结合,荧光素,的,抗体,去标记细胞内的特定蛋白,1949,年,Wallace Coulter,申请了在,悬液中计数粒子,的方法的专利,1950,年,Caspersson,用显微,UV-VIS,检测细胞,流式细胞术发展史,1953,年,Croslannd-Taylor,应用,分层鞘流,原理，成功设计红细胞光学自动计数器,1969,年,Van Dilla,及其同事在,Los Alamos,NM,发明第一台,荧光,检测细胞计,1972,年,Herzenberg,研制出,细胞分选,器,1975,年,Kohler,等提出,单克隆抗体,技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂,大量厂家不断生产流式细胞仪,流式细胞术发展史,目前国内主要流式细胞仪厂家：,Beckton Dickinson(BD),公司,BACKMAN COULTER,公司,流式细胞仪构造,流式细胞仪,(Flow Cytometer,，,FCM,),的结构分五部分：,流动室及液流驱动系统,激光光源及光束成形系统,光学系统,信号检测与存贮、显示、分析系统,细胞分选及浓缩系统,流式细胞术,(Flow Cytometry,，,FCM,),图示如下页：,流式细胞仪构造模式图,流式细胞仪构造示意图,流动室与液流驱动系统,流动室,是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。,流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔，供单个细胞通过。,流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。,鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成,流体动力学聚焦,，从而得到准确的细胞荧光信息。,流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。,流动室与液流驱动系统,激光光源及光束成形系统,目前台式机,FCM,，大多采用氩离子气体激光器。,激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚焦，形成约,22,66,m,的光斑，这样激光能量较强，以激发荧光染料。,台式机的整个光路是封闭的，在安装时由工程师调试完毕后，无需用户作任何调节，使用十分方便。,激光光源及光束成形系统,光学系统,FCM,的光学系统由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们将不同波长的荧光信号分别送入到不同的电子测控器。,主要光学原件：,滤光片,(Filter),长通滤片,Long Pass Filter,LP,短通滤片,Short Pass Filter,SP,带通滤片,Band Pass Filter,BP,长通滤片,短通滤片,带通滤片,信号检测与分析,当细胞携带荧光素标记物,，通过激光照射时，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间,360,度立体角发射，产生,散射光,和,荧光,信号。,以激发光光源波长,488nm,为例示意图：,荧光信号示意图,散射光信号,散射光信号不依赖任何样品的制备技术,（如染色），因此称为细胞的物理参数。,前向散射角,(Forward Scatter,，,FSC,),：,与细胞的大小有关，在,FCM,应用中，常取,FSC,作阈值，来排除样品中的各种碎片。,侧向散射角,(Side Scatter,，,SSC,),：,与激光束正交,90,度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度正相关。,散射光信号波长与激光相同,。,散射光信号示意图,Right Angle Light Detector,a,Cell Complexity,Forward Light Detector,a,Cell Surface Area,Incident Light Source,荧光信号,一种是,细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称,自发荧光,。,一种,是,经过特异荧光素标记后,，受激发光照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量就能了解所研究细胞参数的存在与定量。,常用荧光染料,目前台式机,FCM,配置,488nm,激光管常用染料有,PI,(Propidium Iodide),PE,(Phycorey-thrin),FITC,(Fluorescein Isothiocyanate),PerCP,(Peridinin Chlorophyll Protein),PE-CY5,等,633nm,激光管常用染料有,APC,APC-Cy,FCM,测量数据的存贮、显示和分析,目前,FCM,所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达,4,个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。,数据文件为二进制文件，缺乏直观性，数据的显示常用以下几种方式：,直方图,散点图,等高线图,密度图,三维图,直方图,直方图,(Distribution Histogram),横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度,，单位是道数，可以是线性或对数坐标。,纵坐标一般是细胞数。,散点图,散点图,(Dot Plot),X,坐标为该细胞一参数相对含量，,Y,坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。,等高线图和密度图,三维图,设门分析,可以通过设,“,门,”,(Gate),，分析、分选感兴趣的细胞。,FCM,的分辨率,分辨率是衡量,FCM,测量精度的指标，通常用变异系数,CV,表示。,一般要求,CV8,，最好,CV15%,DNA,倍体分析：,结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。,增殖状态分析：,反映了肿瘤的生长速度和侵袭性,正常人骨髓细胞,DNA,分析,(ModiFIT),多发性骨髓瘤,FCM,在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用,DNA,非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志,在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息,DNA,非整倍体的交界瘤应按恶性对待,形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能,DNA,指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标,细胞凋亡分析,细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程,细胞凋亡的主要检查手段,形态学检测,Ladders,实验,流式细胞术检测,与凋亡相关的病理过程,HIV,自身免疫性疾病,肿瘤,细胞凋亡分析,细胞凋亡的主要指标,细胞内酶改变：,Caspase-3,活化,细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：,Annexin V/PI,细胞核,DNA,的断裂改变：,TUNNEL,实验（,APO-BRDU,，,APO-DIRECT,）,凋亡相关蛋白：,Fas,Bcl-2,细胞凋亡,PI,分析,PI-Fluorescence,Events,调亡细胞,正常,G0/G1,期细胞,细胞凋亡,Active Caspases,-,3,细胞凋亡,Caspases,-,3,细胞凋亡,Annexin V,细胞凋亡,Annexin V,细胞凋亡,BrdU,FCM,的应用,免疫学,淋巴细胞免疫分型,淋巴细胞亚群分析,CD4,绝对计数,HIV,的诊断与研究,淋巴细胞,CD4/CD8,分析,CD4,绝对计数,T,细胞活化,细胞移植的交叉配型和免疫状态监测,FCM,的免疫学应用,免疫功能和免疫调控的研究,淋巴细胞和单核细胞的活化,细胞因子的研究,淋巴细胞的增殖,树突状细胞的研究,HLA-B27,检测,淋巴细胞亚群分析,使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析,各淋巴细胞亚群的,百分含量,淋巴细胞亚群的,绝对计数,临床意义,了解在不同情况下体内免疫功能状态,辅助临床疾病的诊断,探索疾病的发病机理、病程、预后,监测、指导临床治疗方案,免疫系统疾病,免疫缺陷病，,AIDS,移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测,肿瘤病人化疗后免疫力检测,淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为,B,淋巴细胞,（,CD19+,），与体液免疫有关,T,淋巴细胞,（,CD3+,），与细胞免疫有关,总,T,和总,B,可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病,NK,细胞,（,CD3-CD16+56+,），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,SimulTEST IMK-Lymphocyte,试剂盒,CD45/CD14,，,Leucogate,：确定淋巴细胞门，评估门的有效性，并自动计算淋巴细胞亚群占门内淋巴细胞的比例，排除门内杂细胞的干扰,1/2a,，阴性对照,：确定淋巴细胞的阴性界值，评估实验的非特异染色,CD3/CD19,：分析,T,淋巴细胞和,B,淋巴细胞,CD3/CD4,：分析,T,辅助,/,诱导细胞,CD3/CD8,：分析,T,抑制,/,细胞毒性细胞,CD3/CD16+56,：分析,T,淋巴细胞和,NK,细胞,淋巴细胞双色分析,LeucoGATE,：,Back-Gating,，准确圈定淋巴细胞门，并评估门的有效性,淋巴细胞双色分析,AIDS,病人,T,细胞亚群分析,FCM,的应用,血液病学,白血病和淋巴瘤免疫分型,残留白血病,造血干细胞计数,PNH,诊断,网织红细胞分析,血小板分析,血小板膜糖蛋白分子的表达,血小板活化,网织血小板分析,FCM,的应用,分子生物学,分选细胞后进行,FISH,分选细胞后进行,PCR,流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧光原位杂交（,PCR-FISH,）结合测定血液,CD4,细胞中,HIV,特异的,DNA,或,RNA,流式荧光原位杂交（,Flow-FISH,）测定染色体端粒长度,性别选择,FCM,在中医药研究中的应用,我科室开展较多的有如下几个方面的应用：,中药对肿瘤细胞的,细胞周期及凋亡,影响，抗肿瘤中药成份的筛选,中药对细胞表面（细胞因子、激素）,受体表达,的影响,中药对细胞,粘附分子,表达的影响,中药对,淋巴细胞亚群,（反映免疫状态）的影响,针灸及中药对,细胞内,酶的表达影响,中药对,生精细胞,的影响研究,中药治疗,艾滋病,的研究（我实验室仅提供技术支持）,本实验室流式细胞仪及应用介绍,生产厂家：美国,BECTON DICKINSON(BD),公司,型号：,FACSCalibur,激光器：,488nm,和,633nm,各一个,荧光通道（共,4,通道,6,参数）,FSC,及,SSC,：,480-495nm,FL1,：,515-545nm FL2,：,564-606nm,FL3,：,670nm FL4,：,653-667nm,技术参数,分析速度,10000,个,/,秒，分选速度,700,个,/,秒。,常用荧光染料光谱学特征,细胞周期分析,PI,单染,细胞周期分析,PI,单染,细胞周期分析,ModiFit,分析,细胞周期分析,ModiFit,分析,大鼠生精细胞分析,PI,单染,细胞凋亡,PI,加,Annexin V,双染,FITC-Annexin V,PI,淋巴细胞亚群分析,CY5.5-CD3,FITC-CD4,PE-CD8,培养细胞表面粘附分子表达,培养细胞表面粘附分子表达,FCM,样品来源,需要制备细胞悬液,血液、体液等液体样品,培养的细胞,活体组织样品,冰冻组织,固定的组织样品,直接应用,分离后使用,样品制备,细胞分离方法,直接离心沉淀,物理方法分离（超声波、筛网等）,酶消化,如果是固定的组织，先脱蜡，再用物理或化学方法分离,样品染色步骤,PBS,洗细胞,12,次,加（荧光）单抗，暗处孵育,1530,分钟,如果必需，加荧光二抗，暗处孵育,1530,分钟,PBS,洗细胞一次,过,300,目尼龙网,上机检测,PI,单染测细胞凋亡步骤,制备细胞悬液,PBS,洗细胞,1,次，,1000rpm,离心,10min,，去上清。,加,PI,染液（含,PI 50mg/ml,Rnase 50ug/ml),，暗处孵育,30,分钟,过,300,目尼龙网,上机检测,淋巴细胞亚群分析实验,步骤,采集血液样品,取三色标记抗体或三种单色标记混合抗体,20,l,至,Eppendorf,管，加血样,50,l,，混匀后避光保存,20min,。,加入,1,红细胞溶解液,450,l,，混匀避光保存,10min,，,500g,离心,5min,，去上清，加,PBS 1ml,洗,1,次后加,PBS 0.5ml,摇匀。,过,300,目尼龙网，上机检测。,更多相关实验内容请见本实验室网页,谢谢！,