抗原抗体反应.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,*,姓名：张瑞玲 学号：201,59147,专业：药物化学 课程：免疫基础原理,第七章 抗原与抗体相互作用,1,第一节：抗原抗体反应特点,阶段性,2,第一节 抗原与抗体反应的特点,一、特异性,抗原与抗体相互结合只局限于一些大分子表面的特定部位，即抗原决定簇和抗体结合位点之间，且以亲和力的作用方式结合在一起。抗原抗体的结合并没有共价键形成，而是由这些特定部位之间的短程分子力相互作用的结果。这些吸引力只有在极短的距离内才有效。因此抗原决定簇与抗体结合位点在空间上必须处于紧密接触状态，才能产生足够的结合力。这种分子间的互补结构决定了抗原抗体结合的专一性。,3,抗原抗体分子间的作用力,.,4,5,抗原抗体交叉反应,抗原抗体专一性反应,交叉反应,无反应,6,二、,抗原与抗体结合的可逆性,抗原抗体的结合反应是一个可逆的反应,Ab+Ag Ab:Ag,可逆性指复合物在一定条件下可发生解离，恢复抗原抗体的游离状态。抗原抗体结合是分子表面的结合。,影响因素,：,a.抗体对相应抗原的亲合力亲合力越高，结合越牢固，越不易解离,b.环境因素对复合物的影响:,pH、离子强度,应用,：由于抗原抗体结合的可逆性，,可利用亲和层析法分离纯化抗原或抗体,；利用待测抗原和标准抗原与抗体的竞争结合，进行抗原或抗体的定量测定，如放免检测法、酶联免疫吸附法等,7,三、抗原与抗体反应中量的,关系,eg,沉淀反应,抗体过量,平衡点,抗原过量,抗体,抗原,前带,后带,抗 原 抗 体 沉 淀 量,抗体一定抗原增加,前带,(prezone)：抗体过量,后带,(postzone)：抗原过量,等价带,(equivalence zone)：,抗原抗体比例合适,8,抗原与抗体反应中量的关系,比例性（,proportionality,）是指抗原与抗体发生可见反应需要一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时，才形成较大的抗原抗体结合物。以沉淀反应为例，在加入固定量抗体的一排试管中，再依次加入一定量的递增浓度的抗原进行反应，结果发现随着抗原浓度的增加，沉淀很快出现，但抗原超过一定范围之后，沉淀速度和沉淀量随抗原浓度增加反而降低，甚至到最后不出现沉淀，沉淀反应的速度反映了参加反应的抗原和抗体浓度的适合程度，适合程度高反应快，反之则慢。通常把最迅速出现可见反应时的抗原抗体的浓度比或量比称为抗原抗体反应的最适比（,optimal ratio,）或称等价点（,equivalence point,）。抗原与抗体比例最合适的范围称等价带（,equivalencezone,）。在最适比反应条件下，抗原抗体几乎全部结合成复合物，上清液中基本无游离的抗原和抗体。当抗原和抗体浓度比超过此范围时，可见反应的速度和复合物的量都会迅速降低，甚至不可见，上清液中可测出游离的抗原或抗体。因抗原抗体比例不合适而不出现可见反应，称带现象（,zone phenomenon,）。如果抗体过量时，称为前带（,prozone,）；抗原过量时，称为后带（,postzone,）。在同一抗原抗体反应系统中，不管抗原和抗体浓度如何变化，其沉淀反应的最适比始终恒定不变，,Marrack,提出的网格学说解释了抗原抗体反应比例性的机制。天然抗原大多是多价的，抗体至少为两价，当抗原与抗体在等价带结合时，相互交叉连接成具有立体结构的网格状复合体，形成肉眼可见的沉淀物。当抗原或抗体过剩时，由于过剩方的结合价得不到饱和，只能形成较小复合物，并存在有较多游离的抗原或抗体，不能出现可见反应。但是，当抗原或抗体为单价，不管抗原与抗体的量比关系是否合适，均不能出现可见反应现象。,9,三、抗原与抗体反应的阶段性,10,当抗体与抗原结合时，如果是颗粒抗原，则出现凝集现象；如果是可溶性抗原，则产生沉淀作用，,是抗原抗体反应的继发过程。,当抗原与同型抗体相遇时，在合适条件下，不论彼此量的多少，都立即发生特异性的结合形成抗原抗体复合物，这一过程通常只需要几秒的时间便可完成，,称为反应的一级阶段。,三、抗原与抗体反应的阶段性,11,在一级阶段之后，,继发,出现抗原与抗体间进一步,交联,而形成,网络状凝集物,，进而出现可见的凝集和沉淀，称为反应的,二级阶段。,二级阶段,是抗原抗体,网格生长的阶段,，速率要,慢,的多。,影响因素：很大程度上依赖于,温度,、,离子强度,等外界条件，但更重要的是需要,合适的抗原抗体分子比例,。,只有当二者的结合价彼此,饱和,时，才能连接成一个大网格样凝集物，出现凝集或沉淀。,12,抗原抗体凝集（沉淀）反应形成的条件：,1,、抗原结合价必须在,2,价以上；,2,、抗体结合价也必须是,2,价或,2,价以上；,3,、抗原抗体能形成复合物但不一定能形成沉淀；,4,、抗原抗体结合形成大分子凝集物的前提是要求其结合价彼此饱和；,5,、当抗原大大过量时，只有溶解状态的抗原抗体复合物，而无沉淀出现，在免疫检测中称为前带现象。,13,第二节 影响抗原抗体反应的因素,14,一、反应物自身因素,抗原,:,理化性状、表位种类和数目,1,、抗原,抗原的理化性状、抗原决定簇的数目和种类均可影响血清学反应结果 例如，可溶性抗原与相应抗体反应出现沉淀，而颗粒性抗原与相应抗体反应则出现凝集,;,单价抗原与抗体结合不出现可见反应,;,粗糙型细菌在生理盐水中易出现自凝；红细胞与,IgG,类抗体结合不出现直接凝集等。,15,反应物自身因素,抗体,:,来源、特异性、亲和性、效价,2,、抗体,抗体是血清学反应中的关键因素，对反应的影响表现在以下三个方面,:,(1),来源,:,来自不同动物的免疫血清，其反应性有差异。家兔等大多数动物的免疫血清具有较宽的等价带，通常在抗原过量时才易出现可溶性免疫复合物,;,马等大动物和人的免疫血清等价带较窄，少量的抗原或抗体过剩，均可形成可溶性免疫复合物,;,家禽免疫血清不能结合哺乳动物的补体，并且在高盐浓度（,80g/L NaCl,溶液中沉淀现象明显。单克隆抗体一般不适用于沉淀反应或凝集反应,(2),特异性与亲和力,特异性和亲和力是影响血清学反应的两个关键因素，它们共同影响试验结果的准确程度。免疫动物早期获得的抗血清特异性较好，但亲和力低,;,后期获得的抗血清一般亲和力较高，但长期免疫易使免疫血清中抗体的类型和反应性变得更为复杂。因此，用于诊断的试剂必须尽量选用特异性高、亲和力强的抗体，才能保证和提高试验结果的可靠性。,16,（,3）浓度:,抗体的浓度往往是与抗原相对而言。合适的浓度才出现明显的反应现象。因此许多试验应进行抗体预滴定，找出最适反应浓度。,17,二、环境因素,电解质,:,生理盐水或缓冲液,酸碱度,:pH6,pH9,温 度,:15,40,，,37,最适,18,1,.,电解质,抗原抗体结合后由亲水性变为疏水性，此时易受电解质影响，如有适当浓度电解质存在，就会使抗原抗体失去一部分电荷而相互凝集或沉淀，出现可见反应,;,若无电解质存在，则不出现可见反应。通常在血清学试验中，以,85g/LNaCl,溶液作为抗原抗体的稀释液及反应液，其中,Na+,和,Cl-,可分别中和胶体颗粒上的电荷，使胶体颗粒的电势下降，形成可见的沉淀物或凝集物。但如果电解质浓度过高，则会出现非特异性蛋白质沉淀，即盐析。补体参与的溶细胞反应，除需要等渗的,NaCl,溶液外，还需适虽的,Mg2+,和,Ca2+,离子参与。,19,2.,酸碱度,合适的,pH,是抗原抗体反应的必要条件之一。血清学试验一般以,pH6-9,为宜，超出此范围可影响抗原和抗体的理化性质，导致假阳性或假阴性结果。当,pH,为,3,左右时，接近细菌抗原的等电点，可出现非特异性酸凝集，造成假象。,20,21,3.,温度,抗原抗体反应一般在,15,一,40,范围内均可进行，最适温度为,37,。在此范围内温度越高，分子运动速度加快，增加抗原抗体接触机会，反应速度越快，但亦容易引起复合物解离,;,温度越低，反应速度缓慢，但抗原抗体结合牢固，易于观察。某些特殊的抗原抗体反应需要特定的温度，如冷凝集素在,4,时与红细胞结合，,20,以上反而解离。,22,T,23,4,、作用时间,抗原抗体反应应有足够的时间，不同反应时间不同,24,此外，抗原抗体反应在液相中反应时，适当振荡与搅拌，也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。,25,第三节：主要的抗原抗体反应类型,免疫电泳,对流免疫电泳,对流免疫电泳,26,第三节 抗原与抗体反应,-,免疫检测法,抗原与抗体结合后，只有出现可见的反应，如凝集、溶血、沉淀实验等，或用荧光素、酶、放射性同位素等标记方法提高可测性，才便于在免疫检测中运用。可见性反应的出现，对抗原抗体分子合适比例的要求远比对彼此绝对量方面要高得多。这就是说，一方面在进行免疫检测时要注意抗原抗体的用量；另一方面只要提高可见度或可测性，便可大大提高免疫检测方法的灵敏度。,27,一、凝集反应（,Agglutination),凝集反应是指,颗粒抗原,(,凝集原,),与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。,抗原称为凝集原,(agglutinogen)。,抗体称为凝集素（,agglutinin),28,二、沉淀反应,当抗原是,可溶性分子,时，与抗体结合则形成沉淀。,1,、絮状沉淀反应,一系列试管中加入等量的抗体和递增量的抗原，在中性条件下,37,度保温,1-2h,，便可见到絮状的沉淀。可用于寻找抗原抗体反应的合适比例，,检测抗原抗体的分子比。,29,寻找抗原抗体反应的合适比例,30,2,、环状沉淀反应,在试管中加入抗体后，小心加入相应抗原，使抗原抗体步混合，,37,度保温,10-20min,，在二者界面上出现环状沉淀。不能用于定量测定。,该试验主要用于,鉴定,微量抗原，,如,法医学,中鉴定血迹，,流行病学,用于检查媒介昆虫体内,的微量抗原等，,因该技术敏感度低，且不能作两种以上抗原的,分析,鉴别，现已少用。,31,3、双向扩散试验,在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最恰当的比例处形成抗原抗体沉淀线，观察这种沉淀线的位置、,形状,以及对比关系，可作出对抗原或抗体的,定性分析,。,沉淀线如靠近抗原孔，则指示抗体含量较大；,靠近抗体孔，则指示着抗原含量较多；,不出现沉淀线则表明抗体或抗原过剩；,另外，如出现多条沉淀线，则说明抗原和抗体皆不是单一的成分。因此，可用于,鉴定抗原或抗体的纯度。,当抗原、抗体存在多种体系时，会出现多条沉淀弧。,32,双向扩散法的操作,：,生理盐水配制,1%-5%,的琼脂，取,4mL,倒在显微镜用的载玻片上，凝固后打孔,.,中心孔滴抗原，,外周孔滴抗体,用于测定抗体效价,。中心孔滴抗体，,外周孔滴抗原，用于检测抗原的存在和定性抗原。,33,抗原抗体为单一体系浓度不同,抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉淀弧的特征不同：,抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧有多条，彼此互不干扰。,右,34,两种受检抗原（,Ag-1,3.Ag1,）有相同表位，形成一个完全融合的沉淀线,抗体为双价，两种抗原完全不同（,Ag-1,和,Ag-24,）,抗体为双价，两种抗原（,Ag-1,和,Ag-12,）皆有相同的,1,表位，又有不同的,2,表位，所以沉淀线呈部分融合的形状。,这种技术作为抗原的分析，是目前免疫化学中最常用的鉴定技术之一。,。,35,4,、单向免疫扩散,：又称单向琼脂扩散，是,定量抗原,的一种检测方法。与双向扩散不同的是在,琼脂中含有一定量的抗体,，孔内加入未知量的相应抗原。在,37,度保温过程中，孔内的抗原向周围扩散，与抗体形成沉淀圈。根据沉淀圈的大小,确定抗原的含量,36,5,、免疫电泳技术,37,A,、免疫电泳,免疫电泳为区带电泳与,免疫双向扩散,的结合，是由,Grabar,和,Williams,（,1953,）首先报道的。,先利用区带电泳技术将不同电荷和分子量的蛋白抗原在琼脂内,分离,开，,然后,与电泳方向平行在两侧开槽，加入抗血清。置室温或,37,使两者扩散，各区带蛋白在相应位置与抗体反应形成弧形沉淀线,38,B,、对流免疫电泳,对流免疫电泳实质上是定向加速度的免疫双扩散技术，其基本原理是：在琼脂板上打两排孔，一侧各孔加入待测抗原，一侧孔内放入相应抗体，,抗原在阴极侧,，,抗体在阳极侧,。通电后，带负电荷的抗原泳向阳极抗体侧，而抗体藉电渗,作用,流向阴极抗原侧，在两者之间或抗体的另一侧（抗原过量时）形成沉淀线。,39,C,、,火箭电泳,单向扩散发展起来的一,项定量技术，,实质上是加速度的单向扩散。在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；加入待测标本后，将,抗原置阴极,端，,进行电泳,。抗原泳向阳极，,在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀,随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，,形成峰状的沉淀区，形状,似火箭，抗体浓度,保持,不,变，峰的高度与抗原量呈,正比。,+,40,三、补体结合试验,(Complement fixation test,CFT),当抗体与细菌、红细胞等颗粒抗原结合并形成抗原抗体复合物后，可结合补体引起溶菌、溶血效应。用补体结合试验既可以测知患者血清中补体的总量，也可以检测未知抗原或抗体的量。,测定人血清补体总量的方法是以绵羊红血球的溶血为指示。当绵羊红血球与抗绵羊红血球结合后，加患者血清，观测溶血程度。,41,补体结合试验,42,四、中和试验,(Neutralization test),特异性抗体抑制多种抗原的生物学活性（细菌外毒素的毒性、酶的活性、病毒的感染性等）的反应。例如在临床实验诊断中测定风湿病患者体内的抗链球菌,O抗体的反应。,43,第四节 免疫亲和层析,生物高分子具有能和某种相对应的专一分子可逆结合的特性，例如酶的活性中心或别构中心能和专一的底物、抑制剂、辅助因子效应剂通过某些次级键相结合，并在一定条件下又可以解离。抗体与抗原，激素及其受体，核糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系，都具有类似的特性。这种高分子和配基之间形成专一的可解离的复合物的能力称为亲和力。根据这种具有亲和力的生物分子间可逆的结合和解离的原理发展起来的层析就称为亲和层析。,44,亲和层析法的基本过程：,1,、偶联：将欲分离的高分子物质的配基在不影响其生物功能的情况下与水不相溶性的载体结合，制成亲和吸附剂或免疫吸附剂。,2,、装柱：在层析柱内装入固相化的配基,3,、亲和层析：含有高分子物质的混合液在有利于配基和高分子之间形成复合物的条件下进入装有亲和吸附剂的层析柱。高分子物质结合留在柱内，其他杂质流出。,4,、洗脱：改变条件，促使配基和高分子物质分离而释放出需要的物质。,5,、再生：将亲和层析柱的充分洗涤再生，用于下一周期的纯化工作。,45,46,47,The End,48,三、现代免疫标记技术,免疫标记技术(Immuno-labelling technique)是指将抗原或抗体用荧光素、酶、放射性同位素和电子致密物质等加以标记，借以提高其灵敏度的一类新技术。,优点：特异性强、灵敏度高、应用范围广、反应速度快、容易观察、能定位、定量甚至定位。,旺雕彤俊仑肖负规谎寇傻抵世编蹬忧侄到资同章哪份贵炬腊邯兑凶非粹舀抗原抗体反应及应用抗原抗体反应及应用,49,1、免疫荧光技术（Immunofluorescence technique),将结合有荧光素的荧光抗体进行抗原抗体反应的技术。,常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC)和罗丹明（lissamine rhodamine B200,RB200)等。它们可与抗体球蛋白中赖氨酸的氨基结合，在蓝紫光激发下，可分别出现鲜明的黄绿色及玫瑰红色。,伺楚爹雾魏毯髓荆朝计宙叼迟们焕岸檬遂聘蜕字俊矿薛腐贱客代狗杂铝娜抗原抗体反应及应用抗原抗体反应及应用,50,2、酶免疫测定（Enzyme immunoassay,EIA),用酶标记的抗体或抗抗体来进行的抗原抗体反应。,用酶代替荧光素作标记物以及显示酶标记抗体的方法是用酶的特殊底物来处理标本。由于酶的催化作用可使原来无色的底物通过水解、氧化或还原反应而显示颜色。,和瞎仓灭荔烂疆鲁先府哀选煎凭匠宗滁枉持宗释叛茬泉箱韦的啦申樟鞍亩抗原抗体反应及应用抗原抗体反应及应用,51,免疫酶测定的优点,1）反应结果产生颜色，可用显微镜观察结果。,2）标本经酶标抗体染色后，还可用其他染料复染，显示细胞形态结构。,3）标本可长久保存，随时备查。,4）特异性强。,5）灵敏度高。,澡幻坑创琳略趴罩此袍六你普唤奢裳旨冉赂谈日茸择山衙乖婶销鹤巷红脐抗原抗体反应及应用抗原抗体反应及应用,52,标记酶应具备的特点,1）纯度高、高溶性、特异性强、稳定性高。,2）测定方法应简单、敏感、快速。,3）与底物作用后会呈现颜色。,4）与抗体交联后，仍保持酶活性。,最常用的标记酶是辣根过氧化物酶（horeradish peroxidase,HRP),怔欠梯绸突绑谨香渣潞括莹霓滨买阻组竖磺浅耗辛吟壤烯栈郊撅诚艇浅矿抗原抗体反应及应用抗原抗体反应及应用,53,酶联免疫吸附试验法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),常用的方法：,双抗体夹心法（Double antibody sandwich method),间接免疫吸附测定法（Indirect immunosorbent assay）,淮右猴列炕埃灰缸便疵浙免另雨室迁昨策报铲嗜鹰涣圃化棒常兆捅乘州羊抗原抗体反应及应用抗原抗体反应及应用,54,酶联免疫吸附试验,图,7.12 两种酶联免疫吸附试验示意图,锁裁掠批砂萄猩廓豪醚娩柞姿振佰注牵久徊茬颧滚既谓锡粉悼军摘傀柔郑抗原抗体反应及应用抗原抗体反应及应用,55,双抗体夹心法,是一种测定待检标本中是否含有抗原的方法。,丰针播效虹陨漏日誊尝撩庸势敛楔调吹蛙命逛番九励蔑妙狐蛆琼朽催熔罕抗原抗体反应及应用抗原抗体反应及应用,56,双抗体夹心法主要步骤,1）将含已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板的小孔内，洗涤一次。,2）加入待测抗原，如两者是特异的，则发生结合，将多余的抗原洗去。,3）加入对待测抗原有特异性的酶联抗体，使形成“夹心”,4）加入该酶的底物，然后产生可见的有色酶解产物。,三几峻崇棵丫滋彦再听邪急肾徐炎凑也鲜确挛鸵嵌澈锌雅巍院臼十人痘屿抗原抗体反应及应用抗原抗体反应及应用,57,间接免疫吸附测定法,是一种检测血清中是否含特定抗体的方法。,夯马膛催刀辜签陈诚痔歇首欣咸娶继汝猪小人邯余报抑补具际桩审琢绒豹抗原抗体反应及应用抗原抗体反应及应用,58,